Срубы и бани по всей России
Вот уже 10 лет на рынке

Гост 31015 2021 pdf: ИндигоСофт | ГОСТ 31015-2002

• alexxlab
• 09.01.202120.05.2021
• 0

Документация – ООО ‘АБЗ КАПОТНЯ’

Оценка качества дорожно-строительных материалов

Исследования, проведённые на стадии проектирования дорожного полотна и выбора материалов, позволяют предотвратить использование смесей, которые не смогут обеспечить требуемый уровень качества и долговечность конструктивного слоя. ООО «Лабораторно-исследовательский центр» предлагает услуги по оценке качества строительных материалов, асфальтобетонных смесей и их компонентов (песка, щебня, гравия, минеральных добавок, битумов и других инертных материалов). По фактическим результатам можно спрогнозировать срок службы будущего покрытия и подобрать оптимальный состав смесей.

Испытания асфальтобетона

Асфальтобетон – высокопрочный материал, применяемый для укладки дорог и полов технических помещений. Порядок проведения исследований для определения качества асфальтобетонов прописан в ГОСТ 9128-2009 и ГОСТ 31015-2002. В зависимости от типа испытаний готовят опытные образцы в виде брусков или цилиндров. Тестирование проводится на специальных установках с разрушением заготовок или без. Исследования проводят при широком температурном диапазоне от -25 С до +60 С. Для определения некоторых характеристик допустимо использовать расчётную методику.

Предусматривается комплексное определение важнейших характеристик:

• физико-механические – водонасыщение, набухание, пористость, плотность смеси и её минеральной части, термостойкость волокон;
• эксплуатационные – устойчивость к колееобразованию, появлению трещин, воздействию шипованных шин.

Испытания инертных материалов

На дорожное покрытие постоянно воздействуют силы трения, давление, природно-погодные факторы.

По полученным данным лабораторных испытаний дорожно-строительных материалов заказчик сможет спроектировать конструкцию полотна с учётом климатических условий региона и транспортной нагрузки.

Экспертиза щебня (гравия) проводится в соответствии с требованиями ГОСТ 8269.0, ГОСТ 8269.1. В лабораторных условиях определяется истираемость (И), дробимость (М), сопротивление ударным нагрузкам, морозоустойчивость (F), коэффициент уплотнения. Это наиболее важные показатели сыпучих инертных компонентов, применяемых при строительстве автодорог.

Песок исследуется на зерновой состав, гигроскопичность, размер зерна, плотность, коэффициент пористости. В состав асфальтобетонных смесей для дорожного полотна должен входить чистый средне- и крупнозернистый песок с примесью глинистых частиц не более 1% для обеспечения высокого уровня сцепления колёс с дорогой. 

Выполнению работ по обустройству дорожного полотна должны предшествовать лабораторные испытания дорожно-строительных материалов. Применение компонентов и смесей с несоответствующими нормативам показателями не только сокращает срок эксплуатации автомобильной инфраструктуры, но и представляет угрозу для жизни и здоровья людей. Лаборатория ООО «ЛИЦ» оснащена современным оборудованием и средствами измерения, которые позволяют в кратчайшие сроки и с высокой точностью определить качественные характеристики компонентов и готовой конструкции.

Возврат к списку

Укладка асфальтобетонных смесей с наступлением неблагоприятных погодных условий — Новости — Пресс-центр — Главная — Департамент государственного жилищного и строительного надзора Свердловской области Официальный сайт

19 октября 2016

Укладка асфальтобетонных смесей с наступлением неблагоприятных погодных условий

В связи с наступлением неблагоприятных погодных условий для укладки асфальтобетонных смесей Департамент напоминает, что при проведении данных работ необходимо строго руководствоваться нормативными документами (СНиП 2.05.02–85, СНиП 3.06.03–85 и т. д.), предписывающими укладку асфальтобетона в четко регламентированных температурных условиях (не менее + 10°С осенью и + 5°С весной при сухой погоде).

Особое внимание необходимо обращать на температуру асфальтобетонных смесей при укладке в конструкцию дорожной одежды, которая напрямую зависит от удаленности асфальтосмесительных установок до места укладки и времени транспортировки, с учётом интенсивности дорожного движения в городских условиях и количества дорожных заторов на пути движения автосамосвала.

Дальность и длительность возки приводят к остыванию поверхностного слоя горячего асфальта в местах его контакта с воздухом и кузовом самосвала. При транспортировке тяжелые фракции асфальта осаждаются на дно самосвала, а низкая теплопроводность асфальтобетонной смеси приводит к тому, что охлажденные куски корки, образовавшейся при транспортировке, попадая из кузова самосвала в бункер асфальтоукладчика и далее – под его плиту, не разогреваются до температуры основной массы асфальта, т. е. до 130-140 0С. Эти сравнительно холодные куски образуют «холодные пятна», имеющие температуру на 15–30 0С меньше, чем температура основной площади покрытия. Уплотняется такое дорожное покрытие неравномерно. «Холодные пятна» оказываются недоуплотненными, склонными к повышенному влагонасыщению и характеризуются пониженной прочностью и сдвигоустойчивостью.

При переходе температуры окружающего воздуха через 0 0С такие участки разрушаются значительно быстрее, чем основная часть покрытия, так как влага, находящаяся в слое асфальта, переходит в твердое состояние – лед. Переход из жидкого состояния в твердое сопровождается увеличением занимаемого объема, и разрушает покрытие изнутри. При интенсивном движении автотранспорта, под воздействием нагрузок от его колес, быстрее разрушаются именно эти участки. Отсюда выбоины и локальные трещины покрытия, существенно понижающие его общую долговечность и проявляющиеся зачастую через 1–2 года эксплуатации.

В соответствии с ГОСТ 31015–2002 «Смеси асфальтобетонные и асфальтобетон щебеночно-мастичные» температура смесей в зависимости от применяемого битумного вяжущего при отгрузке потребителю и при укладке должна соответствовать значениям, указанным в таблице:

В соответствии с п. 10.13 СНиП 3.06.03-85* «Автомобильные дороги» температура асфальтобетонных смесей (наиболее применяемых в настоящее время) при укладке должна соответствовать значениям, указанным в таблице:

Обращаем Ваше внимание, что указанные нормы также следуют соблюдать при строительстве внутриквартальных проездов, тротуаров, пешеходных дорожек, площадок и т.п.

При выявлении нарушений установленного порядка строительства в ходе проведении проверок, в том числе отклонений при укладке асфальтобетонных смесей, специалистами Департамента осуществляются действия, направленные на привлечение субъектов административных правонарушений к административной ответственности, предусмотренной Кодексом об административных правонарушениях Российской Федерации.

Назад к списку

Взаимосвязь состава асфальтобетонных смесей и физико-механических характеристик покрытия

[1]
А.Ю. Кудрявцев, Контроль качества продукции асфальтобетонного завода, Вестник Информационных систем и технологий.67 (5) (2011) 67-73. (На русском).

[2]
И. Багаудинов и др., Интенсификация производства асфальтобетонных смесей, Механика XXI века. 11 (2012) 353-358. (На русском).

[3]
А.Остроух В. и др. Автоматизация управления технологическим процессом асфальтобетонного завода // В мире научных открытий // В мире научных открытий, 66 (6) (2015).

[4]
ЧАС.Да-юн, Ю. Цзю-цин, Проектирование распределенной компьютерной системы управления на основе полевой шины для асфальтобетоносмесителя, Международная конференция 2010 года по компьютерным приложениям и системному моделированию (ICCASM 2010). 15 (октябрь 2010 г.) 515-587.

DOI: 10.1109 / iccasm.2010.5622496

[5]
Циньу Сюй, К.Чанг Джордж, Адаптивный контроль качества и принятие плотности материала дорожного покрытия для интеллектуального дорожного строительства, Автоматизация в строительстве. 62 (2016) 78-88.

DOI: 10.1016 / j.autcon.2015.11.004

[6]
Ф.Пейрет, Р. Таски, Система прослеживаемости между заводом и рабочим местом для асфальтовых покрытий, Компьютерное проектирование строительства и инфраструктуры. 19 (1) (2004) 54-63.

DOI: 10.1111 / j.1467-8667.2004.00337.x

[7]
Сиконг Чжу и др., Разработка автоматизированной системы дистанционного контроля качества асфальтобетонного покрытия, Журнал транспортных исследований. 2672 (26) (2018) 28-39.

DOI: 10.1177 / 0361198118758690

[8]
Икиу Тан и др., Анализ положения и меры противодействия преждевременным повреждениям конструкций асфальтового покрытия, Исследования и разработки в области автомобильных дорог и транспорта. 5 (2012) 002.

[9]
С.Алексиков В.В. Укладка горячих асфальтобетонных смесей при ремонте городских дорог, Вестник Волгоградского государственного архитектурно-строительного университета. 17 (2010) 35-42. (На русском).

[10]
С.Алексиков В. Исследование причин преждевременного разрушения асфальтобетонных покрытий городских дорог, Дороги и мосты. 1 (29) (2013) 113-124.

[11]
Алиреза Мохаммадиния и др., Влияние летучей золы на свойства щебня и регенерированного асфальта в основаниях / основаниях дорожных покрытий, Опасные материалы. 321 (2017) 547-556.

DOI: 10.1016 / j.jhazmat.2016.09.039

[12]
Д.С. Блэк, Д.А. Строев, С.А.Батыров, Гармонизация требований европейских стандартов гранулометрического состава СМА-11 (СЧМА-11) с учетом требований российских стандартов, Инженерный вестник Дона. 42 (3) (2016) 112-120. (На русском).

[13]
А.Траутвайн, В. Ядыкина, М. Лебедев, А. Акимов, Предварительные исследования конверсионного мела как минерального порошка для асфальтобетонных смесей, Вестник БГТУ. В.Г. Шухов. 6 (2018) 21-27. (На русском).

[14]
А.И. Траутвайн, А.Е. Акимов, В.П. Денисов, М. Лашин, Особенности метода объемного проектирования асфальтобетона по технологии Superpave, Вестник БГТУ имени В.Г. Шухов. 2 (2019) 56-61. (На русском).

DOI: 10.34031 / article_5ca1f62f6b9a09.67742444

[15]
А.Н. Кузьмин, П.Е. Манохин, Использование инновационных методов производства асфальтобетонных смесей без увеличения сметной стоимости проекта, Волжский научный вестник. 12 (1) (64) (2016). (На русском).

[16]
А.А. Худоконенко, С.А. Чернов, Пористые мастичные асфальтобетонные смеси и опыт их использования, Вестник МГСУ. 12 (11) (110) (2017). (На русском).

DOI: 10.22227 / 1997-0935.2017.11.1284-1288

[17]
Н.Селиверстов Д. Выбор асфальтобетонных смесей при холодном ресайклинге дорожных покрытий // Наука о полимерах. Д. 9 (1) (2016) 106-109.

DOI: 10.1134 / s1995421216010184

[18]
В.Ядыкина, А.Гридчин, А. Траутвайн, В. Холопов, Эффективность использования добавок РАА-ТА для приготовления теплого асфальтобетона, прикладная механика и материалы. 865 (2017) 259-262. (На русском).

DOI: 10.4028 / www.scientific.net / amm.865.259

[19]
М.Завьялов А. Кириллов, Методы оценки ресурса асфальтобетонных покрытий, Инженерно-строительный журнал. 2 (2017) 42–56.

[20]
В.Ядыкина, А. Траутвайн, А. Акимов, Е. Яковлев, Влияние пропитки «ДОРЛУК» на физико-механические характеристики асфальтовых покрытий, Перспективные исследования материалов. 1147 (2018) 48-52. (На русском).

DOI: 10.4028 / www.scientific.net / amr.1147.48

[21]
Б.Б. Тельтаев, С. Росси, С. Ашимова, Состав и реологические характеристики битума при кратковременном и длительном старении, Инженерно-строительный журнал. 81 (2018) 93–101.

[22]
Государственный общеобразовательный стандарт 9128–2013.Асфальтированная дорога, аэродромные и асфальтобетонные смеси, Технические условия, Enter 01.01.2013, Госстандарт России, Москва, (2013).

[23]
Государственный общеобразовательный стандарт 31015-2002, Смесь асфальтобетонная и асфальтобетонная мастика, Технические условия, Ввод 01.05.2003, Госстандарт России, Москва, (2003).

(PDF) Свойства асфальтобетона с наполнителем из серы

Свойства асфальтобетона с наполнителем из серы

Виталий Гладких2, *, Евгений Королев1, Дмитрий Гусид1, Илья Сухачёв2

1Московский государственный строительный университет, наноматериалы и нанотехнологии

Учебный центр, Ярославское ш.26, 129337, Москва, Российская Федерация

2Тюменский индустриальный университет, ул. Володарского, 38, 625000, г. Тюмень, Российская Федерация

Аннотация. В настоящее время повышение функциональной надежности асфальтобетонных покрытий

связано с различными модифицирующими добавками, повышающими долговечность дорожных покрытий

. Перспективный строитель — сера техническая. Асфальтобетон

, изготовленный с использованием сложного вяжущего, состоящего из нефтяного битума

и технической серы, получил название асфальтобетон с расширенным содержанием серы.Такой асфальтобетон

, из-за изменения химического состава частиц

и битума, меняет интенсивность взаимодействия на границе раздела, имеет

повышенных показателей физико-механических свойств. Отсутствовали существенные знания о механических свойствах серо-

битумного бетона с такой добавкой; Таким образом, мы провели необходимое обследование

. Выявлено, что новый материал соответствует местным нормам

в отношении прочности на сжатие и растяжение, сопротивления сдвигу,

и внутреннего трения.

1 Введение и предшествующие работы

Как показывает практика, асфальтобетонные покрытия во всем мире деформируются и разрушаются до положенного

и

гарантийного срока и, как правило, требуют ремонта после первых лет эксплуатации.

К причинам преждевременного разрушения и деформации относятся: высокая проходимость, возрастающие осевые

нагрузки, нарушение технологии производства и производства конструкции, а также плохое

качество используемых материалов.

Одно из решений проблемы продления срока службы дорожных покрытий

, связанное с задачей получения материала, надежно работает при переходе от положительных

к отрицательным температурам, с другой стороны, под воздействием интенсивных движение.

Повышение функциональной надежности асфальтобетонных покрытий в настоящее время в Российской Федерации

и за рубежом связано с применением различных модифицирующих добавок, способствующих

улучшению качества дорожных покрытий.К таким модификаторам относятся термопластичная смола, резиновая крошка

,

и другие [1-4]. Существует множество способов улучшить эксплуатационные свойства бетонов на основе термопластичного вяжущего. Посредством нанесения полимеров

, распределенных на поверхности мелкодисперсного наполнителя, можно устранить ряд недостатков традиционного материала

с термопластичной матрицей [5-6]. Недостатком такого подхода является

как следствие дополнительной стадии обработки при приготовлении бетонной смеси.

Битумная матрица асфальтобетона может быть усилена полиолефинами. В частности, в

добавление измельченного полиэтилена уменьшает проникновение увеличивает

* Автор для переписки: [email protected]

DOI: 10.1051 /

, 0 (2016)

MATEC Web of Conferences matecconf / 2016

86

860 4024

IPICSE-2016

4024

© Авторы, опубликовано EDP Sciences. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями Creative

Commons Attribution License 4.0 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

Идентификация нервных колебаний и эпилептиформных изменений органоидов головного мозга человека

ВВЕДЕНИЕ

Было показано, что органоиды мозга, полученные из эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hESCs и hiPSC), воспроизводят уникальные особенности развития человеческого мозга и все чаще используются в качестве модельных систем для получения нового представления о различных неврологических заболеваниях ^1–3 . Органоиды представляют собой значительный прогресс в наборе инструментов, доступных для понимания функций человеческого мозга и механизмов заболеваний, поскольку большая часть наших текущих знаний получена из исследований эмбриональных и взрослых животных, особенно грызунов.Несмотря на то, что общие механизмы развития мозга в процессе эволюции в значительной степени сохраняются, становится все более очевидным, что человеческий мозг обладает многими отличительными чертами, которые не характерны для других видов ^{4, 5} , и остается неясным, насколько хорошо животные модели неврологических заболеваний точно воспроизводят человеческие патологии. Более того, нейромодулирующие препараты, показавшие свою эффективность в облегчении неврологических заболеваний у животных, часто оказываются неэффективными при участии в клинических испытаниях ^{6, 7} , что подчеркивает необходимость систем на основе клеток человека для помощи в оценке эффективности лекарств.

Большинство исследований органоидов головного мозга на сегодняшний день основаны на анатомических и цитоархитектурных характеристиках органоидов для моделирования нарушений, которые сильно влияют на рост или организацию человеческого мозга, таких как микроцефалия, макроцефалия и лиссэнцефалия ^1–3 . Однако разнообразные функции человеческого мозга зависят не только от его стереотипной анатомической структуры, но также от создания и функционирования нейронных микросхем и их сборки в физиологически активные нейронные сети.Действительно, считается, что ошибки в формировании этих цепей или повреждения после их надлежащего развития лежат в основе ряда неврологических заболеваний, начиная от аутистического спектра и психоневрологических расстройств до эпилепсии и болезни Альцгеймера ^{8, 9} . Надежная оценка сетевой активности становится особенно важной в ситуациях, когда имеется явное клиническое заболевание, но нет явных структурных аномалий мозга.

Несмотря на многочисленные доказательства организационной сложности органоидов мозга, присутствие сложных нейронных сетей только недавно было продемонстрировано на живых препаратах цельных органоидов ^{10, 11} .Ключевым отличительным признаком надежных нейронных сетей является наличие различных частот колебательной активности. Считается, что такая активность зависит от точно настроенных тормозно-возбуждающих взаимодействий нейронов и может быть записана из интактных и разрезанных препаратов мозга, но не достижима в двумерных культуральных системах ^{12, 13} . Кроме того, специфические изменения осцилляторной активности, такие как потеря гамма-ритмов или появление полиморфной низкочастотной активности, могут быть четкими индикаторами основной неврологической дисфункции ^14–16 .

Здесь мы стремились разработать и охарактеризовать сетевую активность органоидов головного мозга, используя последние достижения в области органоидной техники ¹⁷ для создания «слияния» органоидов коры головного мозга и ганглиозов (Cx + GE), в которых возбуждающие и тормозные нейроны функционально интегрируются ^{18 –20} . Затем мы использовали комбинацию изображений сенсора кальция и внеклеточных записей потенциалов локального поля, чтобы продемонстрировать наличие сложной активности на сетевом уровне, включая колебательные ритмы.Эта работа основана на предшествующих подходах, которые анализировали сетевую активность в корковых органоидах с использованием только визуализации индикатора кальция или многоэлектродных записей на основе пластин ^{10, 11, 17, 21} . Достижения, заключенные в настоящих методах, позволили нам четко различить патологическую сеть и колебательные изменения в слитых органоидах, содержащих мутации в Methyl-CpG Binding Protein 2 ( MECP2) ген, связанный с синдромом Ретта ²² . В соответствии с в целом подобными паттернами клинических электроэнцефалографических аномалий у пациентов с мутантами MECP2 и , а также случаями вариабельности между пациентами ^{23, 24} , мы идентифицировали консервативные физиологические изменения в органоидах, генерируемых несколькими линиями hiPSC, полученными от двух пациентов, а также некоторые физиологические изменения. действия, которые были различными для каждого испытуемого пациента.В обоих случаях мы обнаружили, что дисфункция нейронной сети была частично устранена лечением нетрадиционным нейромодулирующим препаратом Пифитрин- α . В совокупности эти результаты обеспечивают основу того, как органоиды головного мозга могут быть использованы для исследования функций человеческого мозга на сетевом уровне, и иллюстрируют их полезность при моделировании неврологических расстройств и терапевтического тестирования.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Слияние органоидов коры головного мозга и ганглиозных возвышений позволяет собирать нейронные сети с обильными возбуждающими и тормозными синаптическими связями

Поскольку корковые цепи in vivo содержат смесь как возбуждающих, так и тормозных связей, мы попытались воспроизвести этот процесс, используя Техника «слияния» органоидов для объединения отдельно генерируемых корковых и подкорковых органоидов и, таким образом, создания интегрированных структур (рис.1). Органоиды, полученные из линий hESC H9 или ИПСК дикого типа, были направлены на идентичность коры головного мозга (Cx) или ганглиозного возвышения (GE) через отсутствие или присутствие агонистов пути Sonic hedgehog (Shh) в схеме дифференцировки органоидов (рис. 1a) ¹⁷ . В отсутствие передачи сигналов Shh органоиды преимущественно проявляли кортикальный характер, включая экспрессию апикального и базального маркера предшественника радиальной глии PAX6, промежуточного маркера предшественника TBR2 (EOMES), маркеров глубокой кортикальной пластинки, включая TBR1, CTIP2 (BCL11B) и BHLHB5 (BHLHE22). ), так и маркеры поверхностного слоя, такие как SATB2 и BRN2 (POU3F2) (рис.1b и 3, см. Также ^{17, 25} ). Органоиды, стимулированные путем Shh, по контрасту экспрессируют канонический ген-предшественник и маркеры мигрирующих интернейронов, такие как NKX2.1, DLX1, DLX2 и OLIG2. Со временем в культуре многие нейроны внутри органоидов ГЭ экспрессировали общие ГАМКергические тормозящие нейронные маркеры GAD65 (GAD2) и ГАМК вместе с различными маркерами подтипа интернейронов (рис. 1b, 3 и 4; расширенные данные рис. 4 и 7, рис. см. также ^{17, 25} ).

Рис. 1. Получение и характеристика слитых органоидов головного мозга.

( a ) Схема, описывающая формирование, формирование паттерна и слияние органоидов дорсальной коры (Сх) и вентрального ганглиозного возвышения (GE). ( b ) Иммуногистохимический анализ hESC H9 или немутантных органоидов Cx и GE, полученных из hiPSC, перед слиянием в указанные дни (D) дифференцировки in vitro. (c ) Перед слиянием органоиды D56 Cx или GE инфицировали вирусом AAV1-CAG: tdTomato, что позволяло отслеживать клетки, исходящие из каждого компартмента. Через две недели после слияния меченые Cx клетки обнаруживают ограниченную миграцию в соседние Cx или GE структуры (левое и среднее изображения), в то время как меченые GE предшественники обнаруживают устойчивую миграцию и колонизацию своего Cx партнера (правое изображение).( d ) Иммуногистохимический анализ, показывающий смешение кортикальных нейронов SATB2 ⁺ с DLX5 ⁺ GAD65 ⁺ ингибирующими интернейронами в кортикальном компартменте D106 Cx + GE, но не слитых органоидов Cx + Cx. ( и ) На 84-й день слияния Cx + Cx (левые панели) содержат многочисленные возбуждающие синапсы, отраженные заметной совместной локализацией пре- и постсинаптических маркеров VGLUT1 и PSD95, но при этом редкое количество тормозных синапсов, обнаруженных при помощи VGAT / GEPHYRIN .Cx + GE слияния (правые панели), с другой стороны, содержат многочисленные возбуждающие синапсы VGLUT1 ⁺ / PSD95 ⁺ и тормозные синапсы VGAT ⁺ / GEPHYRIN ⁺ (правые панели).

В развивающемся переднем мозге in vivo, происходящие от GE интернейроны мигрируют тангенциально в соседнюю кору и функционально интегрируются в корковые нейронные сети, процесс, который может повторяться in vitro ^18-20 . Используя аденоассоциированный вирус (AAV) -tdTomato, мечение органоида GE перед слиянием Cx + GE, мы наблюдали широко распространенную миграцию клеток tdTomato ⁺ , происходящих из GE, и дисперсию в соседнем Cx через две недели после слияния, так что ~ 18% клеток Сх были tdTom ⁺ (рис.1a, c и расширенные данные рис. 1а, г). Минимальная миграция клеток tdTomato ⁺ наблюдалась в контрольных слияниях Cx + Cx или Cx + GE, где Cx был предварительно помечен AAV-tdTomato. Наблюдалась высокая степень воспроизводимости колонизации ингибирующих интернейронов в компартменте Сх, что в среднем приводило к конечному проценту ~ 25% клеток, являющихся ГАМКергическими (Фиг.1d, 3c-d ) , наравне с 20 Плотность -30%, наблюдаемая в неокортексе млекопитающих in vivo ^{26, 27} . Это число также оказалось постоянным для разных партий органоидов (расширенные данные, рис.1а-б).

Иммуногистохимический анализ кортикального аспекта слияний Cx + GE выявил смешение возбуждающих нейронов, происходящих из Cx, примером которых является SATB2, который не экспрессируется в органоидах GE, и тормозные интернейроны, идентифицированные с помощью костейнга GAD65 и DLX5 (рис. 1d). Напротив, слияния Cx + Cx экспрессируют только нейрональный маркер SATB2 с небольшим количеством клеток GAD65 ⁺ DLX5 ⁺ , если они вообще отсутствуют (Fig. 1d). Интеграция возбуждающих и тормозных интернейронов в органоиды Cx + GE была дополнительно подтверждена выраженностью обоих возбуждающих синапсов, отличающихся друг от друга пресинаптической точкой VGLUT1 ⁺ и постсинаптической точкой PSD95 ⁺ , а также тормозными синапсами, визуализированными с помощью VGAT и окрашивания гефирином ( Инжир.1д). Для сравнения, органоиды Cx + Cx в основном содержат только возбуждающие синаптические точки (Fig. 1e), указывая тем самым, что большинство тормозных синапсов в органоидах Cx + GE происходят от GE.

Органоиды слияния кортикального слоя и ганглиозного возвышения проявляют сложную активность нейронной сети, включая интернейрон-зависимые многочастотные колебания органоиды и внеклеточные записи локальных потенциалов поля (LFP) (рис.2а). В соответствии с существующими протоколами записи срезов ex vivo, записи LFP и визуализация кальция выполнялись в присутствии низких уровней каината, достаточных для того, чтобы вызывать колебания, но не вызывать припадочную гипервозбудимость

²⁸ .

Рис. 2 Cx + GE слитые органоиды демонстрируют сложную активность нейронной сети, включая колебательные ритмы.

( a ) Схема, иллюстрирующая идентификацию активных нейронов на основании их переходных процессов Ca ²⁺ (I), представление их сетевой организации (II) и методы, используемые для сбора внеклеточных записей (III).( b ) Пример живого изображения с помощью 2-фотонной микроскопии гибридного органоида, полученного из hESC H9, демонстрирующий получение представляющих интерес областей (красные кружки) и результирующий профиль активности, показанный как нормализованное изменение флуоресценции (ΔF / F), где каждая линия — отдельный нейрон (средний график) и представление тех же данных в виде раскрашенного графика амплитуды (справа). ( c ) Добавление 100 мкМ бикукуллинового метиодида (ИМТ) оказывает минимальное влияние на слияния Cx + Cx (вверху), но вызывает спонтанную синхронизацию нейронных активностей в органоидах Cx + GE (внизу).( d ) Эти синхронизации могут быть преобразованы в нормализованный график зависимости амплитуды от времени для количественного анализа (слева) и далее визуализированы в виде кластерограммы после иерархической кластеризации данных о пиках кальция (справа). ( e ) Объединенные данные измерений амплитуды. На графиках отображается полное распределение отдельных точек данных с пунктирными линиями, обозначающими значения медианы и квартиля. n = 3 для Cx + Cx и Cx + GE. ANOVA P = 0,0011, F = 8.301, за которым следует множественное сравнение Тьюки; ** P = 0,0028 для Cx + Cx vs Cx + GE BMI; ** P = 0,0100 для ИМТ Сх + Сх + ИМТ Сх + GE; ** P = 0,0031 для Cx + GE vs Cx + GE BMI. ( f-h ) Потенциалы локального поля, измеренные при типичном слиянии Cx + GE, выявляют устойчивую колебательную активность на нескольких частотах в течение 5-минутного периода, что отражается как на необработанных кривых (f), так и на спектрограмме (g). Анализ спектральной плотности (h) демонстрирует наличие нескольких отчетливых колебательных пиков в диапазоне от 1 до 100 Гц.( i-k) Cx + Cx слитые органоиды, напротив, не обладают измеряемой осцилляторной активностью. Репрезентативные следы в ( f-h ) взяты из 3 независимых экспериментов, а в ( i-k ) — из 4 независимых экспериментов.

Мы применили методы ограниченной неотрицательной матричной факторизации (CNMF-E) для обработки сигналов кальция, чтобы извлечь динамику пиков из записей ^{29, 30} . Это позволило нам выполнить беспристрастную категоризацию динамики кальция отдельных клеток в функциональные кластеры микросхем (расширенные данные, рис.2-3 и дополнительные видео 1-3). В сочетании с данными LFP этот подход позволил нам охарактеризовать физиологическую активность органоидов мозга на уровне отдельных клеток, микросхем и сетей. После инфицирования вирусом AAV-GCaMP6f мы измеряли спонтанную активность кальция как изменения флуоресценции GCaMP6f ( Δ F / F, фиг. 2b). Как Cx + Cx, так и Cx + GE слияния обнаруживают сравнимые исходные нейронные активности (Fig. 2c и Extended Data Fig. 3). Однако, когда мы оценили роль ингибирования путем добавления либо антагониста рецептора GABAA бикукуллина метиодида (BMI), либо габазина, только слияния Cx + GE показали функциональную связь ГАМКергических интернейронов с глутаматергическими клетками.Оба препарата вызывали повторяющиеся волны почти полной синхронизации переходных процессов кальция в слияниях Cx + GE (рис. 2c, d), без такого эффекта в слияниях Cx + Cx (рис. 2c-e и дополнительные видео 4-7). Иерархическая кластеризация выявила большие группы нейронов с сильно коррелированной активностью в органоидах Cx + GE после обработки BMI, тогда как только небольшие группы наблюдались в органоидах Cx + Cx (Fig. 2d).

Рис. 3. Слитые и неслитые органоиды при синдроме Ретта имеют сходную корковую организацию и профили экспрессии клеточного типа.

( a и b ), Получение и иммуногистохимический анализ изогенных органоидов Cx и GE из hiPSC пациента с синдромом Ретта, которые либо содержат (iCtrl), либо не содержат (Mut) экспрессию MECP2 (см. Также ³⁹ ). Органоиды iCtrl и Mut Cx обнаруживают сравнимое образование нейральных предшественников (SOX2, TBR2), нейронов как глубокого, так и поверхностного слоя (CTIP2, BRN2) и тормозных интернейронов (GAD65, SST и GABA). ( c и d ) Не слившиеся с D100 органоиды iCtrl и Mut Cx демонстрируют минимальную экспрессию GAD65, тогда как ~ 20-25% клеток в конце возраста Cx совпадают с органоидами Cx + GE, экспрессирующими GAD65, n = 3 органоиды, 2631 клеток, нс, не значимо. (e и f) Иммуногистохимический анализ подтипов интернейронов по коэкспрессии GAD65 с SST, калретинином, NPY или кальбиндином в части Cx 100-го дня слитых органоидов iCtrl или Mut Cx + GE выявляет наличие нескольких интернейронов. подтипы ( e ). ( f ) Подсчет клеток выявляет тенденции, но нет статистически значимых различий между образцами iCtrl и Mut в отношении процента клеток, экспрессирующих указанные маркеры интернейронов, n = 3 слитых органоида на генотип, ≥ 980 клеток для каждого количество образцов подсчитано, нс = не значимо.Графики в ( d, f ) отображают полное распределение отдельных точек данных с пунктирными линиями, указывающими значения медианы и квартиля.

Измерения LFP в необработанных органоидах слияния выявили одновременные устойчивые колебания на нескольких частотах от 1 до 100 Гц в слияниях Cx + GE (рис. 2f-h), отличительный признак зрелых нейронных сетей in vivo ³¹ . Никакой заметной осцилляторной активности в структурах Cx + Cx не наблюдалось (рис. 2i-k). Эти находки подтверждают, что присутствие происходящих из GE ингибиторных интернейронов стимулирует созревание возбуждающих кортикальных сетей, как было показано в мозге грызунов ^{32, 33} .Более того, эти данные показали, что интернейроны уникальным образом вовлекают поведение возбуждающих клеток в слияниях Cx + GE, и что результирующие сети были способны производить сложные колебания, подобные тем, которые наблюдаются при экстра- и внутричерепных записях интактного мозга.

слитые органоиды мутанта MECP2 (синдром Ретта) сохранили клеточную организацию и состав по сравнению с изогенными контролями

Затем мы использовали эту платформу для измерения патофизиологических изменений, связанных с неврологическими заболеваниями человека.Синдром Ретта — это нарушение нервного развития, обычно вызываемое мутациями de novo в одной копии гена MECP 2 на Х-хромосоме, при котором у пораженных женщин симптомы проявляются уже в возрасте семи месяцев ³⁴ . У пациенток Ретта наблюдается задержка моторики, когнитивные и психоневрологические расстройства, аутизм и эпилепсия ³⁴ . Однако клеточные дефекты, вероятно, проявляются задолго до появления клинических симптомов. Напр., Недавнее исследование на основе hiPSC показало, что Rett может влиять на пренатальный нейрогенез посредством опосредованных микроРНК изменений активности AKT и ERK ³⁵ .В то время как нейроанатомические изменения в ветвлении дендритов и плотности позвоночника были описаны в нескольких моделях Rett ^{34, 36–39} , грубые структурные аномалии мозга менее распространены.

Из-за случайной инактивации Х-хромосомы пациенты женского пола Rett обычно имеют мозаичный статус MECP2 , причем некоторые клетки экспрессируют, а другие не имеют функционального аллеля MECP2 . Эта особенность позволила изолировать изогенные пары hiPSC от отдельных пациентов, поскольку репрограммирование hiPSC обычно не восстанавливает молчание X-хромосомы ³⁹ .Соответственно, мы генерировали органоиды Cx и GE из изогенного контроля (iCtrl) и hiPSC пациентов с синдромом Ретта MECP2 -мутант (Mut), несущие либо мутацию 705 Δ G, которая приводит к усечению сдвига рамки считывания после аминокислоты 236, либо 1461A>. G-миссенс-мутация, изменяющая c-конец белка MECP2 ³⁹ . Сообщалось, что у первого пациента в анамнезе были электроэнцефалографические аномалии, а у последнего — задокументированная история явных припадков.Мы подтвердили, что ожидаемый положительный или отрицательный статус клеток MECP2 сохранялся после дифференциации hiPSC на органоиды с помощью иммуногистохимии, и не обнаружили явных различий в органоидной цитоархитектуре или клеточном составе в разных образцах (рис. 3a-b; рис. 4 с расширенными данными). 6а).

Затем мы более подробно исследовали состав интернейронов гибридных органоидов, полученных из первой линии пациентов (мутация 705 Δ G). Область коры обоих слияний iCtrl и Mut Cx + GE была неотличима в отношении миграции клеток, меченных AAV-tdTomato, в кортикальном компартменте и содержала аналогичный процент интернейронов GAD65 ⁺ (в среднем ~ 25% всех клеток) ( Рис.3c-d; Расширенные фиг. 1а-б, 5а-б). Иммуногистохимический анализ выявил присутствие нескольких подтипов интернейронов во всех слитых органоидах, включая клетки, экспрессирующие соматостатин (SST), кальретинин (CALB2), нейропептид Y (NPY) и кальбиндин (CALB1). Процентное содержание калретинина, кальбиндина и NPY-положительных групп оказалось немного повышенным в образцах Mut, в то время как SST снизился; однако изменения были скромными и не достигли статистической значимости (рис. 3e-f).

Секвенирование одноклеточной РНК выявляет тенденцию к преждевременной дифференцировке мутантных органоидов MECP2 и умеренные изменения в процентном соотношении подтипов интернейронов

Для получения более полного профиля клеточного состава в слитых органоидах Mut и iCtrl мы выполнили одноклеточную РНК секвенирование (scRNA-seq) на 56-й день перед слиянием органоидов Cx и GE, а также на 70-й и 100-й день слияния Cx + GE.Было выбрано несколько временных точек, чтобы оценить прогрессирование клеток от предшественников к дифференцированным состояниям. Кластеризация UMAP выявила 9 кластеров, которые экспрессировали специфичные для клеточного типа маркеры, включая желудочковые радиальные глиальные клетки (RGC), клетки наружной радиальной глии (oRG), возбуждающие нейроны (нейроны каллозальной проекции верхнего слоя, CPN и нейроны проекции кортико-фугальной области глубокого слоя, CFuPN) и тормозные интернейроны (рис. 4а и дополнительная таблица 1). Мы построили график выражения канонических маркеров, связанных с каждым из этих кластеров (например,g., GAD1 с интернейронами или SATB2 с возбуждающими кластерами), включая многие маркеры, которые мы использовали для иммуногистохимического анализа нейрональных подтипов (рис. 4b и расширенные данные на рис. 7). Гены, связанные с предшественниками астроцитов и созревающими астроцитами (например, экспрессия GFAP , FGFR3 , AQP4 и ALDh2L1 ), перекрываются с кластером oRG (рис. 4a и расширенный рис. 7b), но не разделяются на отчетливый кластер астроцитов, отражающий высокую степень сходства в экспрессии генов между этими типами клеток.

Рис. 4 | Транскриптомный и синаптический анализы выявляют различные клеточные популяции в слитых органоидах с тенденцией к ускоренному созреванию, измененной экспрессии интернейронов и усиленному образованию возбуждающих синапсов в слияниях Ретта.

a ) Аппроксимация и проекция однородного коллектора (UMAP) объединенных органоидов iCtrl и Mut Cx и GE. График включает клетки из 3 органоидов D56 Cx и 3 GE, собранных перед слиянием, 3 органоидов слияния D70 Cx + GE и 3 органоидов слияния D100 Cx + GE.Общее количество секвенированных клеток было следующим: D56 iCtrl, 9306; D56 Mut, 9186; D70 iCtrl, 10931; D70 Mut, 6260; D100 iCtrl, 7561; и D100 Mut, 6698 клеток. (b) Графики отображают средний процент клеток в слитых органоидах, представляющих каждый из кластеров в (a). Разделение данных по статусу iCtrl и Mut показывает тенденцию уменьшения количества предшественников и более дифференцированных нейронов в органоидах Mut по сравнению с образцами iCtrl. (c) UMAP ключевых генов, связанных с каждым из основных кластеров, идентифицированных в (a). (d) Рекластеризованный UMAP поднабора интернейронов из (a) с маркерами подтипа интернейронов, идентифицирующими каждое перекластеризованное подмножество. (e) Процент клеток для каждого из кластеров в (d), сегрегированных iCtrl и Mut, выявляет повышенное количество интернейронов, экспрессирующих PVALB / SST и CALB1 в органоидах iCtrl и клетках, экспрессирующих VIP и CALB2 в образцах Mut. (f) Тепловая карта с относительной экспрессией канонических генов, связанных с интернейронами, в повторно кластеризованных группах. (g ) 10 самых богатых терминов биологического процесса онтологии генов (GO BP), связанных с усиленной или пониженной регуляцией дифференциально экспрессируемых генов при сравнении Mut и iCtrl во всех клетках. ( h ) Иммуногистохимический анализ возбуждающих (VGLUT1 / PSD) и ингибирующих (VGAT / GEPHYRIN) пре- / постсинаптических точек показывает увеличение возбуждающих синапсов в органоидах слияния Mut Cx + GE. Желтые пунктирные прямоугольники на крайних правых панелях отображают типичные области TUBB3 ⁺ , которые использовались для анализа.Две соседние панели демонстрируют необработанное иммуногистохимическое изображение, за которым следуют визуализации программным обеспечением Imaris колокализованных пре- и постсинаптических маркеров. Последние две панели представляют собой увеличенные версии областей, выделенных рамкой. ( i ) Графики количества синапсов на ячейку. Данные были объединены с нескольких органоидов. VGLUT1 / PSD95 (Excit), n = 3 органоида для обоих образцов iCtrl Mut, 1180 клеток; VGAT / GEPHYRIN (Inhibit), n = 4 органоида для образцов iCtrl и Mut, 1654 клеток.ANOVA P = 0,0002, F = 8,387, с последующим множественным сравнением Тьюки; ** P = 0,0088 для Excit iCtrl против Excit Mut; ** P = 0,0014 для Excit Mut против Inhib Mut; ns = не имеет значения. На графиках отображается полное распределение отдельных точек данных с пунктирными линиями, обозначающими значения медианы и квартиля.

Чтобы определить эффекты мутации MECP2 на экспрессию генов и судьбы клеток, мы выполнили анализ дифференциальной экспрессии между всеми клетками в органоидах iCtrl и Mut, а также при разделении их кластерами.Мы обнаружили широко перекрывающиеся профили экспрессии генов с тенденцией к увеличению процента клеток, проявляющих характеристики предшественников в органоидах слияния iCtrl по сравнению с образцами Mut (рис. 4b). Хотя и предшественники, и зрелые клетки наблюдались во все моменты времени, данные показали сдвиг от профилей более незрелых клеток на 56-й и 70-й день органоидов к более зрелым типам клеток, таким как CPN в образцах на 100-й день. Этот сдвиг раньше проявился в образцах мутанта MECP2 .(Расширенные данные рис. 7а).

Учитывая важность функции интернейронов для нейронных колебаний в органоидах слияния, мы выделили популяцию Inh.Neuron из рис. 4a для дальнейшего различения подтипов интернейронов. Мы обнаружили 7 основных субкластеров, определяемых их различными паттернами экспрессии маркерных генов интернейронов, включая SST , NPY , CALB1 и CALB2 , вазоактивный кишечный полипептид ( VIP ) и парвальбумин () PVALB . и вариабельная экспрессия дополнительных генов, связанных с интернейроном, таких как DLX2, DLX5, GAD2, SLC6A1, SLC32A1, LAMP5, SCGN, и TAC1 (фиг.4г-е). В то время как все группы интернейронов присутствовали в органоидах слияния iCtrl и Mut и в большинстве случаев были сопоставимы по количеству, были некоторые скромные, но заметные различия. Образцы iCtrl показали повышенный процент нейронов PVALB ⁺ / SST ⁺ и CALB1 ⁺ , тогда как образцы мутантов Mut содержали больше VIP ⁺ и клеток CALB2 ⁺ (рис. 4д).

MECP2 мутантные слитые органоиды демонстрируют изменения в экспрессии генов, связанных с синапсом, и дисбаланс между возбуждающими и возбуждающими органоидами.ингибирующие синапсы

Затем мы выполнили дифференциальную экспрессию между iCtrl и органоидами слияния Mut как в целом, так и внутри каждой группы клеток (дополнительная таблица 2). Гены, активированные в Mut по сравнению с iCtrl (общее количество клеток), были сильно обогащены генами, связанными с риском аутизма (34% соответствие с модулем генов человека SFARI) и эпилепсией (20% соответствие с DisGeNET Epilepsy C0014544), и включали четыре гена, MEF2C , GRIA2 , SMC1A и ZBTB18 , мутации которых ранее были связаны с фенотипами нервного развития, подобными синдрому Ретта (расширенные данные, рис.8,9b) ^40–44 . Гены с пониженной регуляцией в Mut по сравнению с iCtrl (общее количество клеток) также были обогащены генами, связанными с эпилепсией (соответствие 17%), но не с риском аутизма (расширенные данные, рис. 8).

Затем мы выполнили функциональное обогащение списков генов с повышенной / понижающей регуляцией для всех клеток в органоиде и для основных кластеров (дополнительная таблица 3). Гены, которые были активированы в мутантных органоидах MECP2 , были значительно обогащены терминами онтологии генов (GO), связанными с проекцией нейронов, морфогенезом и синаптической сборкой, тогда как гены, которые были подавлены, были связаны с катаболизмом мРНК, нацеливанием на ER и трансляцией белков (рис. .4г). Большинство этих изменений, особенно связанных с синапсами, были наиболее заметны в кластерах CFuPN и CPN, но не присутствовали в тормозных нейронах (Extended Data Fig. 9a). Среди генов с наибольшей активностью в органоидах Mut были известные гены, связанные с аксонами и синапсами, такие как PCLO , ROBO2 , EFNB2 и NRXN1 . Однако наиболее активным геном в отсутствие функции MECP2 во всех кластерах был NNAT (нейронатин), который участвовал в контроле стресса ER, возбудимости нейронов, переносе рецепторов и кальций-зависимой передаче сигналов ^{45, 46} . Экспрессия NNAT была повышена во всех кластерах, но особенно высока в группах промежуточных предшественников и ингибиторных интернейронов (расширенные данные, фиг. 9b).

Мы, наконец, исследовали статус образования синапсов в кортикальном компартменте слитых органоидов iCtrl и Mut Cx + GE, используя определение костной ткани VGLUT1 / PSD95 для различения пре- и постсинаптических компонентов возбуждающих синапсов и определение стоимости VGAT / гефирина для тормозных синапсов. В соответствии с транскриптомными результатами мы обнаружили значительное увеличение плотности возбуждающих точек в органоидах Mut по сравнению с iCtrl без каких-либо заметных изменений в тормозных синапсах (рис.4f-g). В совокупности эти результаты предполагают, что дефицит MECP2 приводит к изменениям в экспрессии генов, которые в конечном итоге изменяют баланс возбуждающих и тормозных синапсов и могут тем самым влиять на функции нейронной сети.

Слитые органоиды синдрома Ретта проявляют гипервозбудимость и гиперсинхронную сетевую активность

В соответствии с этими синаптическими данными и, что еще более поразительно, различия в активности были выявлены с помощью визуализации GCaMP6f. В слияниях Mut Cx + GE наблюдались эпохи спонтанно синхронизированных переходных процессов кальция (рис.5a-c, дополнительные видеоролики 8-9), напоминающие синхронизацию, наблюдаемую после введения антагонистов рецепторов GABAA в контрольные образцы (рис. 2c-e и дополнительные видеоролики 4-5), и эпилептиформные изменения, наблюдаемые в мышиных моделях синдрома Ретта ⁴⁷ . Эти результаты были заметно согласованы для разных партий протестированных органоидов и двух независимых линий клеток Mut, полученных от одного и того же пациента Rett (расширенные данные, рис. 1b, d). Предыдущие сообщения указали на увеличение общей активности и уменьшение размера нервных микросхем в моделях хемоконвульсантной эпилепсии мышей ⁴⁸ .Мы аналогичным образом наблюдали, что повышенная синхронизация переходных процессов кальция в органоидах Mut Cx + GE сопровождалась уменьшением как размера кластеров микросхем, так и количества нейронов в каждом кластере (расширенные данные, рис. 10a).

Чтобы расширить эти результаты, мы генерировали органоиды слияния Cx + GE из второй группы линий hiPSC пациентов Ретта (далее называемых iCtrl-II и Mut-II; были использованы две независимые линии Mut-II). Визуализация индикатора кальция GCaMP6f выявила декоррелированную активность органоидов iCtrl-II, напоминающую результаты предыдущих экспериментов H9 hESC и iCtrl-I hiPSC Cx + GE (расширенные данные, рис.6б, верхние следы; сравните с рис. 2в и 5а). В отличие от этого, органоиды Mut-II демонстрировали множественные случаи, когда отдельные нейроны активировались с быстрой и постоянной скоростью (расширенные данные, рис. 6b, нижние области, выделенные красным прямоугольником; см. Также дополнительные видео 12 и 13), хотя мы не наблюдали гиперсинхронных всплесков, как показано в органоидах Mut-I (расширенные данные фиг. 6b-c, сравните с фиг. 5a-b). Быстрая индикаторная активность GCaMP6f в органоидах Mut-II привела к значительному уменьшению среднего и медианного интервала между спайками и, как и в случае с органоидами Mut-I, к увеличению доли нейронов с множественными спайками (расширенные данные, рис.6г). В соответствии с отсутствием видимой гиперсинхронности, не было никакого влияния на амплитуду синхронизированных переходных процессов (расширенные данные рис. 6d). Эти результаты согласуются с партиями органоидов и клеточными линиями, используемыми в группах iCtrl-II и Mut-II, но значительно различаются между генотипами (расширенные данные, рис. 1b-c). В совокупности эти данные демонстрируют высокую степень согласованности в аспектах фенотипа дисфункции нейронной сети в органоидах MECP2 Mut, связанных с повышенной возбудимостью, но также демонстрируют различные характеристики, основанные на их происхождении от пациентов.

Рис. 5 Слитые органоиды при синдроме Ретта демонстрируют ГЭ-зависимую гиперсинхронную активность нейронной сети.

( a ) Mut Cx + GE слияния демонстрируют спонтанные синхронизированные переходные процессы Ca ²⁺ , которые не видны в iCtrl Cx + GE, отраженные на необработанном цветном графике амплитуды Δ F / F (вверху), график амплитуды синхронизации (внизу) и кластерограмма ( b ). ( c ) Количественная оценка объединенных данных, n = 12 iCtrl и n = 7 органоидов слияния мутаций, **** P <0.0001 для средней амплитуды синхронизированных переходных процессов; ** P = 0,0012 для нейронов с множественными импульсами. ( d ) Смешанные слияния с iCtrl Cx и Mut GE демонстрируют спонтанно синхронизированные переходные процессы кальция, тогда как смешанные слияния с Mut Cx и iCtrl GE этого не делают, как видно на необработанном цветном графике амплитуд ΔF / F (вверху), график амплитуды синхронизации (в центре) и кластерограмма ( e ). ( f ) Количественная оценка объединенных данных, n = 6 iCtrl Cx + Mut GE и n = 5 Mut Cx + iCtrl GE, * P <0.05. Графики в ( c , f ) отображают полное распределение отдельных точек данных пунктирными линиями, чтобы указать значения медианы и квартиля.

Эпилепсия присутствует у 60-80% пациентов Rett и, как полагают, возникает в основном из-за дисфункции интернейронов ^{49, 50} , хотя потеря MECP2 в других типах клеток была связана с синдромом ²² . Поскольку наши органоиды Cx и GE соответственно обогащены возбуждающими и тормозящими интернейронами, мы создали «смешанные» слияния, в которых либо Cx, либо GE половина слитой структуры была Mut-I, а другая половина была iCtrl-I, как средство. определения компартмента и типа клеток, в которых дефицит MECP2 имеет наибольшее значение.Органоиды смешанного слияния Mut-I Cx + iCtrl-I GE показали переходные процессы кальция, почти идентичные несмешанным слияниям iCtrl Cx + GE, и не показали никаких доказательств гиперсинхронности. Напротив, органоиды iCtrl-I Cx + Mut -I GE продемонстрировали гиперсинхронные переходные процессы кальция, подобные несмешанным слияниям Mut-I Cx + GE, хотя увеличения доли нейронов с множественными спайками не было обнаружено (рис. 5d-f и дополнительные видео 10 и 11). Вместе эти данные подтверждают, что дефицит MECP2 и в интернейронах, происходящих от GE, может быть основным драйвером наблюдаемых гиперсинхронных изменений в органоидах Mut-I Cx + GE.

Органоиды слияния синдрома Ретта демонстрируют дефицит низкочастотных и гамма-колебаний, сопровождаемых эпилептиформными высокочастотными колебаниями

Записи LFP слияний iCtrl-I Cx + GE продемонстрировали нечастые всплески и устойчивые низкочастотные и гамма-колебания с несколькими эпохами более высокочастотных колебаний (> 100 Гц), сходный с профилем, показываемым слитыми органоидами, производными H9 hESC (фиг. 6a-e, сравните с фиг. 2d). Напротив, органоиды Mut-I Cx + GE лишены низкочастотных и гамма-колебаний (рис.6b-c «Mut») и вместо этого демонстрировал повторяющиеся всплески, похожие на эпилептиформные, и высокочастотные колебания (HFOs, ∼200-500 Гц; рис. 6a, d-e и расширенные данные, рис. 11). Эти результаты совпадают с данными визуализации кальция, которые показали редкую, но большую синхронизацию кальция с высокой амплитудой или высокочастотное срабатывание в органоидах Mut fusion, которые могут привести к всплескам или HFO, в отличие от многочисленных небольших синхронизаций, наблюдаемых в образцах iCtrl, которые, вероятно, генерируют устойчивые низкочастотные колебания без эпилептиформных явлений (рис.5 и расширенные данные Рис. 5б-г). Гиперсинхрония, HFOs и спайки, наблюдаемые в органоидах Mut Cx-GE, согласуются с электрографическими изменениями, наблюдаемыми при эпилепсии человека ^{51, 52} . Действительно, электроэнцефалографические аномалии или явная эпилепсия были зарегистрированы у обоих пациентов Ретта, чьи hiPSC использовались в этом исследовании ³⁹ .

Рис. 6 Слитые органоиды синдрома Ретта демонстрируют ГЭ-зависимые эпилептиформные изменения.

( a ) Необработанная кривая репрезентативной 10-минутной записи LFP (вверху) и расширенное по времени окно (внизу) от несмешанных органоидов Mut или iCtrl Cx + GE и смешанных Mut / iCtrl слияния Cx + GE.( b и c ) Спектрограммы и периодограммы, полученные из всех записей, показанных в (a). ( d ) График Морле, показывающий высокочастотную активность, связанную с увеличенными во времени сегментами, показанными на (a). ( e ) Гистограмма частот межспайковых интервалов, полученная из необработанной кривой в ( a ). ( f ) Количественная оценка высокой и низкой спектральной мощности гамма-излучения по записям LFP демонстрирует значительное уменьшение мощности гамма-излучения в слияниях Mut Cx + GE и смешанных слияниях с Mut GE.Высокая гамма; Обычный дисперсионный анализ, всего P = 0,0020, множественные сравнения Тьюки, ** P = 0,0018, * P <0,05. Низкая гамма; Обычный дисперсионный анализ, всего P = 0,0174, множественные сравнения Тьюки, *** P = 0,0009, * P <0,05. n = 6 для всех групп (всего 24). ( г ) Частота всплесков в нескольких независимых экспериментах Тест Краскела-Уоллиса, в целом P = 0,0002, множественные сравнения Данна *** P = 0.002, * P <0,05, n = 6 для всех групп. Графики в ( f, g ) отображают полное распределение отдельных точек данных с пунктирными линиями, чтобы указать значения медианы и квартиля.

Мы также выполнили регистрацию LFP на органоидах Cx + GE, полученных из второй линии ИПСК пациентов по Ретту. Органоиды iCtrl-II демонстрировали нечастые всплески и устойчивые низкочастотные и гамма-колебания с несколькими периодами более высокочастотных колебаний (> 100 Гц), аналогичные образцам iCtrl-I (расширенные данные, рис.6e-g «iCtrl-II» сравните с рис. 6a-e и на рис. 2d). Напротив, органоиды Mut-II Cx + GE лишены низкочастотных и гамма-осцилляций и вместо этого демонстрируют повторяющиеся эпилептиформные всплески и высокочастотные колебания (расширенные данные, фиг. 6e-g «Mut-II»). Количественная оценка этих данных выявила значительную потерю низкой мощности гамма-излучения у Mut-II по сравнению с iCtrl-II, существенную, но незначительную потерю высокой мощности гамма-излучения у Mut-II по сравнению с iCtrl-II, а также значительное увеличение пиковой мощности. частота в Mut-II (расширенные данные рис.6h-i). Мы снова наблюдали согласованность этих измерений в партиях органоидов, независимых клеточных линиях от одного и того же пациента и в пределах генотипов с заметными различиями между генотипами (расширенные данные рис. 1b, d).

Чтобы изолировать клеточный источник (интернейроны против возбуждающих нейронов) наблюдаемых колебательных изменений в органоидах слияния Mut, мы выполнили измерения LFP в органоидах смешанного слияния. Органоиды Mut-I Cx + iCtrl-I показали профиль LFP, почти идентичный несмешанным слияниям iCtrl-I Cx + GE (рис.6a-e и расширенные данные рис. 11). Напротив, органоиды iCtrl-I Cx + Mut-I GE демонстрировали частые всплески и HFOs наряду с дефицитом отчетливых низкочастотных колебаний и гамма-активности, аналогичные несмешанным слияниям Mut-I Cx + GE (рис. 6a-e и расширенные данные на рис. .11). Эти данные вместе указывают на то, что дефицит MECP2 в интернейронах, происходящих от GE, является основным драйвером наблюдаемых изменений в функции сети.

Среди этих наблюдений, изменения частоты спайков и гамма-колебаний могут иметь особое значение, поскольку исследования in vivo на людях и мышах показали обратную зависимость между мощностью гамма-диапазона и эпилептиформными разрядами ^{14, 15} .Вдобавок считается, что гамма-колебания требуют сложных тормозно-возбуждающих сетевых взаимодействий, которые очень склонны к нарушению эпилептическими или интерктальными разрядами ¹⁴ . Фактически, сильные гамма-пики постоянно присутствовали в несмешанных органоидах iCtrl-I Cx + GE и смешанных Mut-I Cx + iCtrl GE и постоянно отсутствовали или уменьшались по амплитуде в Mut-I Cx + GE и iCtrl-I Cx + Mut. Структуры GE. В соответствии с этими выводами количественная оценка гамма-спектральной мощности выявила значительную и сопоставимую потерю как низкой, так и высокой гамма-спектральной мощности в несмешанном слиянии Mut-I и смешанном iCtrl-I Cx + Mut GE по сравнению с несмешанным iCtrl-I Cx + GE. расплавы (рис.6f), а также значительно увеличенная частота спайков в этих группах по сравнению с образцами iCtrl-I (рис. 6g). Эти результаты дополнительно подтверждают мнение о том, что основной причиной колебательных дефектов органоидов может быть дефицит MECP2 в клетках, происходящих от ГЭ.

Дефекты нервных колебаний, наблюдаемые в органоидах слияния мутантов MECP2, могут быть частично восстановлены введением нетрадиционного нейромодулирующего препарата пифитрин-α

Известное, но в значительной степени неосуществленное, применение получаемых от пациентов hiPSC находится в персонализированной медицине.Поэтому мы стремились определить полезность фенотипа эпилептиформ, наблюдаемого в органоидах синдрома Ретта, для тестирования на наркотики. Во-первых, мы использовали противосудорожный препарат широкого спектра действия, вальпроат натрия (VPA), который обычно применялся для лечения эпилепсии, вызванной синдромом Ретта ⁵³ . Мы также протестировали эффект предполагаемого целевого ингибитора TP53, пифитрина-α, на основании предыдущих исследований, показывающих, что дефицит MECP2 приводит к чрезмерной активации пути TP53 и преждевременному старению нейронов ^{39, 54} .В соответствии с его известными свойствами подавления всплесков, воздействие VPA значительно снижало активность всплесков в органоидах Mut-I Cx + GE (рис. 7a, c), хотя оно не уменьшало HFO и оказывало умеренное влияние на восстановление низкочастотных колебаний (рис. . 7а-с). Пифитрин-α аналогичным образом уменьшал частоту спайков, но также заметно подавлял HFO и приводил к повторному появлению гамма-колебаний (рис. 7a-c). Почти идентичный ответ наблюдался также с органоидами слияния Mut-II Cx + GE (расширенные данные, рис.6e-i). Мы объединили все эксперименты с LFP и построили график зависимости частоты всплесков от мощности спектра гамма-излучения как для низкого, так и для высокого гамма-излучения и наблюдали ожидаемую обратную зависимость для обеих линий пациентов (рис. 7d и расширенные данные, рис. 6j). Эта обратная зависимость согласуется с тем, что ранее было описано как на мышиных моделях неврологического заболевания, так и на пациентах с эпилепсией у людей ^{14, 15} .

Рис. 7 Частичное восстановление гамма-колебаний и подавление HFO в слитых органоидах синдрома Ретта введением пифитрина-α.

( a ) Необработанная кривая (вверху), расширенное по времени окно (в центре) и периодограмма (внизу) для репрезентативных слитых органоидов Mut Cx + GE, обработанных в течение 48 часов носителем (ДМСО, Veh), 2 мМ вальпроата натрия (VPA). ) или 10 мкМ пифитрина-α (PFT). ( b ) График Морле, полученный из развернутого во времени сегмента на (а). ( c ) Количественная оценка высоких гамма-колебаний и частоты всплесков в Mut Cx + GE показывает весьма значимое спасение как высокой спектральной мощности гамма-излучения, так и снижение частоты всплесков после лечения с помощью PFT и более скромное, но значительное спасение в обоих измерениях. после лечения VPA.Количественная оценка высокой гаммы; Обычный дисперсионный анализ, всего P = 0,0085, множественные сравнения Тьюки, ** P = 0,0093, * P <0,05, n = 4 для всех образцов (всего 12). Частота скачков после добавления препарата; Тест Краскела-Уоллиса, общее значение P = 0,0020, множественные сравнения Данна ** P = 0,0042, * P <0,05. На графике показано полное распределение отдельных точек данных с пунктирными линиями для обозначения значений медианы и квартиля.( d ) Графики зависимости высокой и низкой спектральной мощности гамма-излучения от частоты всплесков демонстрируют обратную зависимость между мощностью гамма-излучения и всплесками. Сплошная черная линия лучше всего подходит после линейной регрессии, а пунктирные пурпурные линии указывают 95% доверительные интервалы. Наклон линии наилучшего соответствия указан в верхней части графика. Рассчитанный наклон значительно отличается от нуля с P <0,0001 для высокой гаммы и P = 0,0007 для низкой гаммы.

Чтобы определить, были ли эффекты лекарственного средства связаны с изменениями в гибели клеток, активацию расщепления каспазы 3 оценивали иммуногистохимическим методом, но не выявили каких-либо существенных различий (расширенные данные, рис. 12). Мы также не наблюдали каких-либо специфических эффектов пифитрина-α на активность LFP слияния iCtrl-I Cx + GE или гибель клеток (расширенные данные, рис. 13). В совокупности эти результаты предполагают, что, хотя VPA в значительной степени снижает гипервозбудимость нейронов, пифитрин-α может дополнительно модулировать более активные физиологические взаимодействия, приводящие к более глобальному восстановлению функций сетевого уровня.Эти результаты дополнительно иллюстрируют потенциальную ценность подхода к моделированию слитых органоидов для создания персонализированных лекарств.

ОБСУЖДЕНИЕ

В совокупности эти эксперименты демонстрируют существование очень сложных физиологических активностей внутри органоидов Cx + GE, соответствующих их цитоархитектурной и клеточной сложности. Эти результаты согласуются с выводами, недавно опубликованными Trujillo et al., Которые также наблюдали появление нервных колебаний в корковых органоидах, культивируемых в течение длительных периодов времени, с использованием другого протокола органоидов и подхода к регистрации ¹¹ .Наши исследования здесь дополнительно демонстрируют, что возникновение сетевых активностей более высокого порядка, таких как многочастотные колебания, требует функциональной интеграции тормозных интернейронов в возбуждающую сетевую структуру, что разрешено техникой слияния органоидов, поскольку без них не было бы никаких колебаний. Важно отметить, что этот подход также позволил нам идентифицировать поразительные электрофизиологические фенотипы у мутантных органоидов Cx + GE MECP2 , несмотря на их цитоархитектурное сходство с образцами iCtrl.Кроме того, использование двух hiPSC, полученных от пациентов Ретта, каждый из которых несет уникальные мутации MECP2 , позволило более уверенно идентифицировать физиологические признаки дисфункции нейронной сети, которые возникают в органоидах мозга при синдроме Ретта. Оказалось, что наблюдается высокая степень воспроизводимости и согласованности результатов нескольких экспериментов, партий органоидов, клеточных линий и способов анализа, что еще раз подтверждает достоверность модели слияния органоидов.

Хотя мы не наблюдали явных различий между органоидами слияния Mut и iCtrl с помощью иммуногистохимических анализов или scRNAseq в отношении основных типов клеток, мы действительно наблюдали тенденции, которые могут способствовать выраженным физиологическим фенотипам, которые мы задокументировали.Возможно, наиболее примечательно и согласуется с нашим открытием, что обогащенный интернейронами компартмент GE в первую очередь объясняет физиологические изменения в органоидах слияния Mut, было относительное обогащение подтипа интернейронов PVALB в iCtrl и подтипа VIP в образцах Mut.

Вместе с интернейронами SST эти два подтипа, как известно, обеспечивают решающий тормозной вход в пирамидные (возбуждающие) клетки, которые, в свою очередь, обеспечивают нервные колебания ⁵⁵ . В частности, считается, что активность PVALB опосредует колебания 20-80 Гц, включая гамма-активность, тогда как интернейроны SST, которые непосредственно ингибируются VIP, как полагают, опосредуют колебания в диапазоне частот 5-30 Гц ^{55, 56} .Таким образом, последовательная потеря низкочастотных колебаний в органоидах слияния Mut может быть результатом опосредованного VIP снижением активности SST, тогда как снижение в клетках PVALB может способствовать резкой потере гамма-колебаний. Кроме того, и в соответствии с этими данными, значительное уменьшение интернейронов PVALB ⁺ также было зарегистрировано в посмертной ткани префронтальной коры аутичных людей ⁵⁷ .

Следует отметить, что в соответствии с нашими данными о LFP, мы также наблюдали относительное снижение экспрессии SST в органоидах Mut с помощью иммуногистохимии, хотя это не наблюдалось в наших данных scRNAseq.Мы также наблюдали умеренное увеличение возбуждающих, но не тормозных синаптических точек в органоидах Mut, что, вероятно, связано с массой транскриптомных изменений, выявленных нашим анализом секвенирования отдельных клеток. Гены, которые дифференциально экспрессировались в органоидах мутанта MECP2 , показали сильную связь с ростом аксонов, образованием синапсов, риском аутизма и эпилепсией. Относительное увеличение возбуждающего воздействия может дополнительно способствовать нарушению нервных колебаний, а также предрасполагать органоиды к повышенной возбудимости.Эти наблюдения и их механистические последствия требуют дальнейшего изучения в будущих исследованиях.

В дополнение к нашим механистическим исследованиям, мы стремились использовать нашу систему в качестве новой платформы для тестирования на наркотики. Мы были заинтригованы открытием более полного спасения фенотипа Mut с помощью нового препарата, пифитрина-α, чем это наблюдалось с традиционным противосудорожным препаратом VPA. Пифитрин-α является предполагаемым ингибитором TP53, который, как было показано ранее, спасает фенотип MECP2 , опосредованный мутацией преждевременного старения нейронов in vitro ³⁹ .В соответствии с возможностью преждевременной активации путей клеточного старения в результате мутации MECP2 , мы также наблюдали тенденцию в наших данных scRNAseq к увеличению количества дифференцированных подтипов нейронов у Mut (CPN, CFuPN, интернейронов) и относительному снижению подтипы предшественников (например, циклические предшественники, oRG, IPC). Эти данные заслуживают будущих исследований как нейромодулирующего действия пифитрина-α, так и роли MECP2 в репрессии путей клеточного старения, опосредованных TP53.

Таким образом, эти результаты иллюстрируют потенциал органоидов мозга как уникальной платформы для характеристики нейронных сетей человека, так и для персонализированных открытий и исследований лекарств. Остается задача определить точные микросхемы и специфические для типов клеток возмущения, которые лежат в основе как осцилляторных, так и патологических эпилептиформных изменений, выявленных в этих исследованиях. Важные ключи к разгадке этого начинания уже были обнаружены в ходе проведенного нами транскриптомного анализа.Система слияния органоидов, которую мы использовали, хорошо поддается такому детальному клеточному и цепному анализу и предоставляет беспрецедентные возможности для моделирования дисфункции нейронной сети, связанной с различными неврологическими расстройствами человека.

МЕТОДЫ

Культура hESC и hiPSC и генерация органоидов

Все эксперименты с hPSC проводились после предварительного одобрения Комитета по надзору за исследованиями эмбриональных стволовых клеток (ESCRO) Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе (UCLA) и Институционального наблюдательного совета.Органоиды коры головного мозга (Сх) и ганглиозного возвышения (GE) были получены из линии hESC H9 ⁵⁸ или hiPSC Ретта ³⁹ , как описано ранее ¹⁷ и схематично показано на фиг. 1a. Слияние было выполнено с небольшими изменениями, как сообщалось ранее ¹⁹ . Органоиды Cx и GE были разрезаны на 56 день, и две половины (например, Cx + GE или Cx + Cx) были объединены в микроцентрифужной пробирке, содержащей 300 мкл среды N2B27 ¹⁷ , и помещены в гипероксический инкубатор, содержащий 5% CO2 и 40%. O2 в течение 72 часов.Затем слитые структуры осторожно переносили в 24-луночные кислородопроницаемые чашки (Lumox, Sarstedt) и выдерживали в гипероксической среде с заменой среды через день до их использования. Эксперименты по миграции нейронов проводили путем инфицирования органоида Cx или GE 5 мкл ∼1.98×10 ¹³ мл ^-1 AAV1-tdTomato (pENN.AAV.CAG.tdTomato.WPRE.SV40, дар доктора Джеймс М. Уилсон, Университет Пенсильвании Vector Core AV-1-PV3365) на 56 день, и слияние было выполнено, как описано, через 3 дня после заражения.

Генерация hiPSC Rett

iPSC Rett были получены из линий фибробластов GM07982 и GM17567, полученных из репозитория клеток Национального института общих медицинских наук, поддерживаемого в Институте медицинских исследований Кориелла, и генерированных лентивирусной трансдукцией клеток с факторами Яманака. (Oct4, Klf4, Sox2 и cMyc), как описано ранее ³⁹ . Клетки GM07982 были изолированы от 25-летней женщины, у которой были выявлены электроэнцефалографические аномалии, и было обнаружено, что они содержат мутацию сдвига рамки считывания, 705delG, в гене MECP2 , что приводит к преждевременному усечению стоп-кодона и белка (E235fs).Клетки GM17567 были выделены от 5-летней женщины с анамнезом значительно аномальных электроэнцефалограмм и судорог, и было обнаружено, что они содержат миссенс-мутацию A> G в нуклеотиде 1461 (1461A> G), что привело к замене на триптофан. стоп-кодона в кодоне 487 (X487W). Поскольку самки Ретта обычно гетерозиготны по мутации MECP2 , собранные фибробласты имеют мозаичный статус белка MECP2, примерно половина клеток экспрессирует немутантный аллель.В отличие от мышиных клеток, неактивная Х-хромосома в клетках человека остается неактивной после репрограммирования до плюрипотентности ⁵⁹ , что позволяет создавать мутантные (Mut) и изогенные контрольные (iCtrl) hiPSCs из фибробластов одного и того же пациента. Подтверждение контроля MECP2 или статуса мутанта было достигнуто посредством иммуноокрашивания и иммуноблоттинга линий ИПСК и дифференцированных органоидов.

Иммуногистохимия

Органоиды фиксировали погружением в 4% параформальдегид, криозащищали 30% сахарозой, замораживали в Tissue-Tek при оптимальной температуре резки (О.C.T., Sakura) media и криосрезов. Иммуноокрашивание проводили с использованием ранее опубликованных лабораторных протоколов ^{17, 60} . Используемые первичные антитела включают следующие: козьи анти-BRN2 (POU3F2; Santa Cruz Biotechnology sc-6029), 1: 4000; мышиное антитело против CALBINDIN (клон CB-955, Sigma-Aldrich C9848), 1: 5000; кроличий анти-КАЛРЕТИНИН (EMD Millipore AB5054), 1: 2000; 1: 500; кроличьи антитела против расщепленной каспазы-3 (Asp175) (Cell Signaling 9661), крысиные антитела против CTIP2 (BCL11B; Abcam ab18465), 1: 1000; кролик анти-DLX1 ⁶¹ (щедрый подарок доктора.Су Гён Ли и Джэ Ли), 1: 3000; анти-DLX2 у морских свинок ⁶² (щедрый подарок докторов Кадзуаки Йошикавы и Хидео Синагава), 1: 3000; анти-DLX5 у морских свинок ⁶² (щедрый подарок докторов Кадзуаки Йошикавы и Хидео Синагава), 1: 3000; кроличьи анти-FOXG1 (Abcam ab18259), 1: 1000; кроличьи антитела против ГАМК (Sigma-Aldrich A2052), 1: 10000; мышиное антитело против GAD65 (BD Biosciences 559931), 1: 200; мышиный анти-ГЕФИРИН (Synaptic Systems 147021), 1: 500; козье анти-LHX2 (C-20, Santa Cruz Biotechnology sc-19344), 1: 1000; кроличьи антитела против MECP2 (Diagenode C15410052), 1: 1000; мышиное антитело против N-CADHERIN (CDh3, BD Biosciences 610920), 1: 800; кроличий антинейропептид Y (EMD Millipore, AB10980), 1: 1000; мышиные анти-NKX2.1 (Novocastra NCL-L-TTR-1), 1: 500; мышиное антитело против PAX6 (банк гибридом исследований развития), 1: 100; кроличьи антитела против PAX6 (MBL International PD022), 1: 1000; мышиное антитело против PSD95 (Millipore MAB1598), 1: 1000; мышиное антитело против SATB2 (Abcam ab51502), 1: 100; козьи анти-SOX2 (Santa Cruz Biotechnology sc-17320, 1: 100; крысиный анти-СОМАТОСТАТИН (SST, EMD Millipore MAB354), 1: 100; кроличьи антитела против TBR1 (Abcam ab31940), 1: 2000; куриные антитела против TBR2 ( EOMES; EMD Millipore AB15894), 1: 1000; кроличий антитубулин B3 (TUBB3, BioLegend, 802001), 1: 1000; анти-VGAT морской свинки (Synaptic Systems 131004), 1: 1000; анти-VGLUT1 морской свинки (SLC17A7 ; EMD Millipore AB5905), 1: 1000.

Вторичное окрашивание антител проводили с использованием Dylight 405-, FITC-, Alexa 488-, Cy3-, Alexa 594-, Cy5-, Alexa 647, Dylight 647-конъюгированных ослиных антивидовых антител IgG или IgM (Jackson ImmunoResearch или Invitrogen / Molecular Probes) в разведении 1: 1000.

Ядра часто контрастировали с использованием Hoechst 33258, добавленного к смеси вторичных антител в конечной концентрации 1 мкг / мл ^-1 . Изображения в основном были получены на конфокальном микроскопе Zeiss LSM 800, за исключением синаптических точек, которые были получены с помощью объектива 63X на конфокальном микроскопе Zeiss LSM 880, оборудованном технологией Airyscan.Все изображения, которые сравнивались напрямую, были получены с одинаковыми настройками мощности лазера. Настройки изображения были ограничены яркостью, контрастностью и уровнем и применялись одинаково ко всем изображениям в сравниваемом наборе.

Подготовка образцов для секвенирования отдельных клеток

Реагенты диссоциации папаина были приготовлены в соответствии с рекомендациями производителя для системы диссоциации папаина (Worthington, # LK003150) с небольшими изменениями. Папаин ресуспендировали в 5 мл среды Hibernate E (Brainbits, #HE), содержащей добавки N2 и B27 (Life Technologies, # 17502048 и # 12587010) (HNB), с получением конечной концентрации 20U папаина / мл, чтобы исключить потребность в 95%. Уравновешивание% O2 / 5% CO2.ДНКазу ресуспендировали в EBSS в соответствии с рекомендациями и осторожно перемешивали, чтобы избежать сдвига, перед добавлением в раствор папаина. Конечный раствор папаина / ДНКазы затем инкубировали при 37 ° C в течение 10 минут перед использованием для обеспечения полной солюбилизации. Три не слившихся Cx и GE (на 56-е сутки) или 3 слившихся органоида (на 70-е и 100-е сутки) объединяли в одну пробирку для каждой диссоциации. Для диссоциации органоиды дважды промывали PBS (Fisher Scientific, # Sh4002802) в 1,5 мл микроцентрифужной пробирке перед переносом в 10-сантиметровую чашку, содержащую свежий PBS.Органоиды осторожно нарезали кубиками на мелкие кусочки, используя лезвие бритвы с одной кромкой (Fisher Scientific, # 12-640), а затем переносили в коническую пробирку на 15 мл и осаждали для удаления PBS. Кусочки органоида затем ресуспендировали в 2 мл раствора папаина / ДНКазы до конечной концентрации 20 Ед / мл. Органоиды инкубировали при 37 ° C при постоянном перемешивании в течение 30 минут. Через 30 минут органоиды вручную растирали 5 раз, используя пипетку на 5 мл, чтобы разбить комки, затем помещали при 37 ° C еще на 15 минут.Через 15 минут органоиды очень осторожно титровали 10 раз наконечником P1000 и помещали еще на 15 минут при 37 ° C. Всего органоиды инкубировали в папаине в течение 1 часа для получения раствора одной клетки. Затем суспензию фильтровали через фильтр 40 мкМ (Fished Scientific, # 08-771-1) в свежую коническую пробирку на 15 мл и центрифугировали при 300 x g в течение 10 минут. Раствор папаин / ДНКаза удаляли, и клетки ресуспендировали в HNB, в котором отсутствует папаин / ДНКаза, и снова центрифугировали. Этот процесс был повторен еще раз, чтобы полностью удалить папаин и большую часть клеточного дебриса.Наконец, клетки ресуспендировали в 1 мл PBS, содержащего 0,04% бычьего сывороточного альбумина, и подсчитывали, используя окрашивание трипановым синим и автоматический счетчик клеток Countess II (Thermo Fisher, # AMQAX1000). Полученный клеточный раствор, используемый для секвенирования отдельных клеток, содержал> 90% живых клеток и был доведен до концентрации клеток 1000 клеток / мкл перед загрузкой на чип 10X Genomics.

Обработка данных Single-Cell RNAseq

файлов FASTQ для каждого образца были обработаны с использованием Cellranger 4.0.0, и подсчеты были созданы с помощью функции «cellranger count» с предоставленной аннотацией refdata-gex-GRCh48-2020-A (10X Genomics). Данные были объединены в объект Seurat, содержащий шесть образцов, с использованием Seurat v3.2.0 ^{63, 64} . Данные были отфильтрованы для клеток с nFeatures_RNA> 500, nFeatures_RNA <среднее + 3 * (стандартное отклонение) и процент митохондриальных генов <10%. Интеграция данных и пакетная коррекция выполнялись с использованием пакета R Linked Inference of Genomic Experimental Relationships (LIGER) ⁶⁵ .Данные были нормализованы с параметрами по умолчанию с использованием функций Сёра NormalizeData () и FindVariableFeatures (). Затем данные были масштабированы с помощью ScaleData (datExpr, split.by = «orig.ident», do.center = FALSE). Затем была выполнена интеграция данных / пакетная коррекция с помощью функций оболочки Seurat для LIGER, включая RunOptimizeALS (datExpr, k = 20, lambda = 5, split.by = «orig.ident») и RunQuantileNorm (datExpr, split.by = «Orig.ident»). Затем данные были кластеризованы с использованием FindNeighbors (datExpr, сокращение = «iNMF», dims = 1:20) и FindClusters (datExpr, разрешение = 0.3). Визуализация UMAP была выполнена с использованием RunUMAP (datExpr, dims = 1: ncol (datExpr [[«iNMF»]]), reduce = «iNMF»). Гены-маркеры кластера определяли с использованием дифференциальной экспрессии между каждым кластером и другими кластерами с использованием функции FindAllMarkers (object = datExpr). Распределение кластеров выполнялось вручную со ссылкой на рассчитанные маркерные гены и маркерные гены общих типов клеток из литературных источников ^66–71 . Чтобы оценить неопределенность в присвоении кластеров, были сгенерированы самонастраиваемые доверительные интервалы для пропорций типов ячеек с использованием дифференциальной композиции отдельных ячеек (scDC) пакета R с функцией scDC_noClustering (cellTypes, subject, calCI = TRUE, calCI_method = «percentile»), где cellTypes были кластерами, а субъекты — клеточными генотипами ⁷² .Различная экспрессия между образцами Mut и iCtrl в целом и внутри каждого кластера определялась с помощью FindMarkers (datExpr, identify.1 = ‘Cluster # _Rett’, identify.2 = ‘Cluster # _Ctrl’), а затем отфильтровывалась для генов с ложной частотой обнаружения ( FDR) <0,05. Гены с повышенной и пониженной регуляцией, прошедшие коррекцию FDR, были упорядочены по кратному изменению, а анализ обогащения онтологии генов был выполнен с использованием функции gost () в gprofiler2_0.2.0 со следующими параметрами. Фоновые гены были ограничены генами, экспрессируемыми в наборе данных с использованием custom_bg = background_genes, Body = «hsapiens», orders_query = TRUE, user_threshold = 0.05, Correction_method = «bonferroni» и sources = c («GO: BP», «GO: MF», «GO: CC», «HP») ^{73, 74} . Для репрезентативных графиков GO (например, рис. 4g и расширенных данных рис. 9a) размер термина был ограничен до 1000, и были нанесены 10 лучших членов по -log10 (значение p) с исключением следующих друг за другом терминов, содержащих идентичные коды свидетельств. Для расширения списка генов, показанного на рис. 8 с расширенными данными, список генов, связанных с РАС, был загружен с https://gene.sfari.org/database/human-gene/, а список эпилепсии (C0014544) с https: // www.disgenet.org/search. Списки генов были сокращены до генов, экспрессируемых в наборе данных единичных органоидов, и сравнивались на перекрытие с генами с повышенной / понижающей регуляцией между Mut и iCtrl при сравнении всех клеток. Для проверки обогащения был проведен точный тест Фишера с использованием функции fisher.test (), а затем соответствующие p-значения были скорректированы для множественных сравнений с помощью p.adjust (p, method = ‘bonferroni’, n = length (p)) .

Количественная оценка клеток и синаптических точек

Все количественные оценки клеток были получены с использованием не менее 9 изображений на образец, состоящего из 3 несмежных областей на изображение и не менее 3 изображений, полученных в независимых экспериментах.Для количественной оценки GAD65 мозаичные изображения слитых или неслитых органоидов были визуализированы в Photoshop (Adobe), поле равного размера использовалось для разграничения интересующих областей на внешних краях органоидов и общего количества клеток GAD65 ⁺ и Ядра Hoechst ⁺ внутри области, выделенной прямоугольником, заносили в таблицу вручную. Синаптические точки были идентифицированы и колокализованы с использованием программного обеспечения обработки изображений Imaris (Bitplane) с использованием идентификатора «пятен», установленного для обнаружения объектов одинакового размера, окружающих клеточные процессы TUBB3 ⁺ , и установлен порог против окрашивания по Hoechst, чтобы исключить любое ядерное перекрытие.Встроенная функция «колокализации» на Imaris использовалась для определения перекрывающихся точек.

Визуализация кальция живого органоида

Генетически кодируемый индикатор кальция GCaMP6f был введен в органоиды между 88-95 днями путем инфицирования 5 мкл 1.98×10 ¹³ GC мл ^-1 pAAV1.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40 virus ⁷⁵ , подарок от доктора Дугласа Кима и проекта GENIE (вирусный препарат Addgene # 100837-AAV1 или ядро ​​UPENN Vector AV-1-PV2822). Все изображения были выполнены через 12-14 дней после заражения с использованием двухфотонного микроскопа Scientifica с перестраиваемым лазером Coherent Chameleon.Переходные процессы кальция регистрировались при возбуждении 920 нм с использованием водно-иммерсионного объектива 20X 0,8NA (Nikon) и с частотой кадров 31 Гц с разрешением 512 x 512 пикселей и полем зрения 0,5 x 0,5 мм. Запись выполнялась в искусственной спинномозговой жидкости (aCSF), как описано ниже, с дополнительными 10 мМ HEPES для поддержания pH 7,3-7,4 в отсутствие перфузии O2 / CO2 (подробности см. В разделе «Внеклеточные записи» ниже). После первоначальной визуализации в отсутствие лекарств органоиды затем подвергали 1-минутной инкубации с антагонистом рецепторов GABAA габазином (25 мкМ) или бикукуллином метиодидом (100 мкМ), и идентичные поля были повторно визуализированы после воздействия лекарственного средства.

Идентификация микросхем

Необработанный Ca ²⁺ файлов изображений в формате tiff были обработаны для идентификации переходных процессов флуоресценции (ΔF / F0) и оценки пиков в MATLAB (Mathworks Inc.) с использованием ограниченной неотрицательной матричной факторизации с расширенным (CNMF) -E) методология ^{29, 30} . После извлечения данных на основе CNMF-E кластеры нейронных микросхем были идентифицированы путем выполнения иерархической кластеризации на корреляционной матрице нейронных данных пиков Ca ²⁺ и проанализированы на основе Muldoon et al. ⁴⁸ . Корреляция между всеми попарными комбинациями динамики спайков для всех нейронов, идентифицированных CNMF-E, была рассчитана для создания корреляционной матрицы. После генерации корреляционной матрицы был выполнен анализ связи с использованием функции MATLAB linkage из набора статистических инструментов (с «полным» / самым дальним расстоянием). Сгенерированная иерархическая кластеризация была введена в функцию дендрограммы из набора инструментов статистики MATLAB с «Color Threshold» , установленным на 1.5 для всех экспериментальных групп. Затем путем присвоения каждого нейрона кластеру, определяемому назначенным ему цветом на дендрограмме, были созданы кластеры, в которых была высокая корреляция между всеми нейронами в кластере. Чтобы вычислить количество пар нейронов, которые были значительно коррелированы в каждом наборе данных, мы сначала сгенерировали 1000 перетасованных временных курсов для каждого нейрона, используя функцию MATLAB randperm . Парные корреляции для случайно перетасованных временных курсов рассчитывались таким же образом, как и исходные данные, и пара нейронов считалась коррелированной, если их коэффициент корреляции в исходных данных значительно отличался от 1000 перетасованных наборов данных с P <0.05. Чтобы определить порог одновременной активации, была рассчитана синхронизация перетасованных данных по времени, и порог был установлен на уровне 99 ^-го процентиля синхронизации в перетасованных данных. Синхронизация выше этого порога считалась «синхронизированной». Затем эти данные были нанесены на нормализованную ось y в диапазоне от 0 (без синхронизации) до 1 (синхронизация 100%), а время — на оси x. Затем были сведены в таблицу общее количество синхронизаций, средняя амплитуда синхронизации и средняя продолжительность синхронизации.

Внеклеточные записи

Органоиды были зарегистрированы в возрасте от 100 до 107 дней. Живые органоиды перфузировали 500 нМ каиновой кислотой в aCSF (содержащем в мМ: NaCl 126, D-глюкозу 10, MgCl2 1,2, CaCl2 2, KCl 5, Nah3PO4 1,25, пируват Na 1,5, L-глутамин 1, NaHCO3 26, pH 7,3- 7.4 при барботировании 95% O2, 5% CO2) для инициирования колебательной сетевой активности. Активность LFP регистрировали с помощью патч-пипетки, заполненной CSF, соединенной с головным каскадом с полевым усилителем (A-M Systems Inc., модель 3000) и полосовой фильтр от 0,1 до 1000 Гц на инструментальный усилитель (Brownlee BP Precision, модель 210A). Полевые потенциалы были оцифрованы при 4096 Гц с помощью платы National Instruments A / D с использованием EVAN (специально разработанное программное обеспечение на основе LabView от Thotec) и проанализированы с помощью специальных процедур (Wavemetrics, Igor Pro 8). Низкочастотная активность была визуализирована для 10-минутных эпох с использованием спектральных плотностей мощности (PSD), которые были рассчитаны с использованием функции «dsperiodogram» Игоря Про, и спектрограмм, которые были созданы с использованием метода Габора на Igor Pro.Высокочастотная активность до 650 Гц была визуализирована путем создания вейвлет-графиков Морле с периодами 0,5-1,0 секунды необработанных трасс, используемых для низкочастотного анализа. Интервалы между всплесками и частоты всплесков были сведены в таблицу на Igor Pro с использованием идентичных 10-минутных периодов, использованных выше.

Статистическая информация

Все образцы подвергались тестированию на нормальность Шапиро-Уилка и Колмогорова-Смирнова. Ненормальные образцы анализировали с помощью двустороннего U-критерия Манна-Уитни или критерия Краскела-Уоллиса с последующим многократным сравнительным тестом Данна.Обычно распределенные данные анализировали с помощью двустороннего теста Стьюдента t- или ANOVA с апостериорным тестом множественного сравнения Тьюки. Графики скрипки отображают полное распределение отдельных точек данных с пунктирными линиями, чтобы указать значения медианы и квартиля. В подписях к рисункам указаны номера образцов и значения P для всех статистических тестов. Каждый n представляет собой независимый эксперимент. В дополнительной таблице 4 указано количество несмежных участков, полученных до выбора репрезентативных изображений. n для всех остальных репрезентативных изображений указан в подписях к рисункам.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим С. Батлера, Т. Кармайкла и сотрудников лаборатории Нович за полезные обсуждения и комментарии к рукописи; J. Buth, N. Vishlaghi и F. Turcios-Hernandez за техническую помощь, а также J. Lee, S.-K. Ли, Х. Синагава и К. Йошикава за ценные реактивы. Мы также благодарим Исследовательский центр широких стволовых клеток Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе (BSCRC) и Центры исследований интеллектуальных и порочных нарушений за доступ к средствам визуализации.Эта работа была поддержана научными наградами Центра комплексных онкологических исследований UCLA Jonsson и Программы стипендий BSCRC Ablon, Фонда исследования стволовых клеток Дэйва Стеффи, Института клинических и трансляционных наук Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе, а также грантами Калифорнийского института регенеративной медицины (CIRM) ( DISC1-08819 — BGN), Национального института здравоохранения (R01NS089817, R01DA051897 и P50HD103557 — BGN; R01NS088571 — JMP; R01NS030549 и R01AG050474 — IM), Frontiers Group Фонда семьи Пола Аллена — K.P. and W.E.L., а также от March of Dimes Foundation для W.E.L. R.A.S. был поддержан грантом на обучение трансляционной нейробиологии UCLA / NINDS (R25NS065723), стипендией для исследований и обучения Американского общества эпилепсии, премией Bridge to Independence от Фонда Саймонса по исследованию аутизма и наградой за обучение от UCLA BSCRC. M.W. был поддержан стипендиями для докторантуры, предоставленными UCLA BSCRC и Uehara Memorial Foundation, а также грантом от NICHD (K99HD096105).О.А.М. и А.К. были частично поддержаны учебной программой CIRM-Bridges в Калифорнийском государственном университете Калифорнии в Лос-Анджелесе (EDUC2-08411). Мы также признательны за поддержку IDDRC Cells, Circuits and Systems Analysis, Microscopy and Genetics and Genomics Cores Института нейробиологии Семела в Калифорнийском университете, которые поддерживаются NICHD (U54HD087101 и P50HD10355701). Мы также признательны за поддержку Сообщества Сотрудничества в области количественных и вычислительных биологических наук (S.M.) и Сообщества Сотрудничества в области количественных и вычислительных биологических наук, возглавляемого Маттео Пеллегрини.

% PDF-1.4
%
4480 0 объект
>
эндобдж

xref
4480 224
0000000016 00000 н.
0000008984 00000 п.
0000009135 00000 п.
0000011194 00000 п.
0000011382 00000 п.
0000011889 00000 п.
0000012456 00000 п.
0000012835 00000 п.
0000013004 00000 п.
0000013307 00000 п.
0000013465 00000 п.
0000013931 00000 п.
0000014504 00000 п.
0000015114 00000 п.
0000015259 00000 п.
0000015506 00000 п.
0000015535 00000 п.
0000015588 00000 п.
0000015911 00000 п.
0000016170 00000 п.
0000016789 00000 п.
0000016904 00000 п.
0000016956 00000 п.
0000017009 00000 п.
0000017062 00000 п.
0000017115 00000 п.
0000017168 00000 п.
0000017221 00000 п.
0000017274 00000 п.
0000017327 00000 п.
0000017613 00000 п.
0000017665 00000 п.
0000017718 00000 п.
0000017770 00000 п.
0000017823 00000 п.
0000017875 00000 п.
0000017928 00000 п.
0000017981 00000 п.
0000018034 00000 п.
0000018087 00000 п.
0000018139 00000 п.
0000018192 00000 п.
0000018244 00000 п.
0000018296 00000 п.
0000018349 00000 п.
0000018401 00000 п.
0000018453 00000 п.
0000018502 00000 п.
0000019020 00000 н.
0000019059 00000 п.
0000019256 00000 п.
0000019306 00000 п.
0000019386 00000 п.
0000019451 00000 п.
0000019503 00000 п.
0000019555 00000 п.
0000019607 00000 п.
0000019659 00000 п.
0000019712 00000 п.
0000019765 00000 п.
0000020031 00000 н.
0000020329 00000 п.
0000020594 00000 п.
0000021195 00000 п.
0000021308 00000 п.
0000021423 00000 п.
0000021684 00000 п.
0000028192 00000 п.
0000034450 00000 п.
0000040828 00000 п.
0000046902 00000 п.
0000053042 00000 п.
0000059318 00000 п.
0000059719 00000 п.
0000059889 00000 п.
0000060360 00000 п.
0000060851 00000 п.
0000061333 00000 п.
0000061895 00000 п.
0000062299 00000 п.
0000062761 00000 п.
0000062827 00000 н.
0000063087 00000 п.
0000063358 00000 п.
0000063618 00000 п.
0000063898 00000 п.
0000064169 00000 п.
0000064555 00000 п.
0000064816 00000 п.
0000065419 00000 п.
0000065687 00000 п.
0000071431 00000 п.
0000076735 00000 п.
0000083038 00000 п.
0000083095 00000 п.
0000117984 00000 н.
0000118216 00000 н.
0000118408 00000 н.
0000145821 00000 н.
0000153704 00000 н.
0000183921 00000 н.
0000203954 00000 н.
0000243259 00000 н.
0000263286 00000 н.
0000279918 00000 н.
0000282634 00000 н.
0000285285 00000 н.
0000302439 00000 н.
0000302478 00000 н.
0000304781 00000 н.
0000312700 00000 н.
0000334572 00000 н.
0000334832 00000 н.
0000334903 00000 н.
0000356764 00000 н.
0000356848 00000 н.
0000365985 00000 н.
0000366234 00000 н.
0000367129 00000 н.
0000367384 00000 н.
0000368539 00000 н.
0000368795 00000 н.
0000369938 00000 н.
0000370193 00000 н.
0000371553 00000 н.
0000372761 00000 н.
0000379511 00000 н.
0000379659 00000 н.
0000379940 00000 н.
0000380190 00000 н.
0000381121 00000 н.
0000381301 00000 п.
0000381710 00000 н.
0000381857 00000 н.
0000382138 00000 п.
0000382393 00000 н.
0000383718 00000 н.
0000383961 00000 н.
0000384730 00000 н.
0000386356 00000 п.
0000386559 00000 н.
0000388213 00000 н.
0000388270 00000 н.
0000388541 00000 н.
0000440283 00000 н.
0000595881 00000 н.
0000596131 00000 п.
0000596966 00000 н.
0000597876 00000 н.
0000598818 00000 н.
0000599073 00000 н.
0000599777 00000 н.
0000601080 00000 н.
0000601328 00000 н.
0000602341 00000 п.
0000602591 00000 н.
0000603482 00000 н.
0000603731 00000 н.
0000604561 00000 н.
0000604816 00000 н.
0000605537 00000 п.
0000605724 00000 н.
0000606129 00000 н.
0000606186 00000 п.
0000606433 00000 н.
0000617365 00000 н.
0000617810 00000 н.
0000644569 00000 н.
0000648558 00000 н.
0000648773 00000 н.
0000652797 00000 н.
0000653002 00000 н.
0000656411 00000 н.
0000736131 00000 п.
0000736260 00000 н.
0000736535 00000 н.
0000736784 00000 н.
0000737598 00000 н.
0000737853 00000 п.
0000738762 00000 н.
0000738907 00000 н.
0000739188 00000 н.
0000739437 00000 н.
0000740302 00000 н.
0000740554 00000 н.
0000741464 00000 н.
0000742713 00000 н.
0000742893 00000 н.
0000743257 00000 н.
0000743512 00000 н.
0000744231 00000 п.
0000745177 00000 н.
0000762022 00000 н.
0000762203 00000 н.
0000762613 00000 н.
0000763560 00000 н.
0000763815 00000 н.
0000764965 00000 н.
0000765920 00000 н.
0000766178 00000 н.
0000766262 00000 н.
0000766319 00000 п.
0000766430 00000 н.
0000766529 00000 н.
0000766722 00000 н.
0000766956 00000 н.
0000767040 00000 п.
0000767097 00000 п.
0000767183 00000 п.
0000767273 00000 н.
0000767397 00000 н.
0000767590 00000 н.
0000776756 00000 н.
0000777017 00000 п.
0000777398 00000 н.
0000785802 00000 н.
0000786065 00000 н.
0000786476 00000 н.
0000796158 00000 н.
0000797406 00000 н.
0000807109 00000 н.
0000817734 00000 н.
0000008735 00000 н.
0000004877 00000 н.
трейлер
] >>
startxref
0
%% EOF

4703 0 объект
> поток
xX {PTg? oGmM # (% ϶yQA $ & k @ $ Q18Ikp8 ltT]: 4Mm0f7⤩fԞT? [UA 9s ~}

% PDF-1.7
%
% ABCpdf 11202
1164 0 объект
>
эндобдж

xref
1164 46
0000000032 00000 н.
0000001875 00000 н.
0000002154 00000 п.
0000002205 00000 н.
0000003327 00000 н.
0000003850 00000 н.
0000004036 00000 н.
0000004283 00000 п.
0000004347 00000 п.
0000004411 00000 н.
0000004602 00000 н.
0000004854 00000 н.
0000004998 00000 н.
0000005032 00000 н.
0000005208 00000 н.
0000005290 00000 н.
0000005557 00000 н.
0000005812 00000 н.
0000006069 00000 н.
0000006262 00000 н.
0000006518 00000 н.
0000006669 00000 н.
0000006703 00000 п.
0000006886 00000 н.
0000006968 00000 н.
0000007244 00000 н.
0000007483 00000 н.
0000007723 00000 н.
0000007964 00000 п.
0000008209 00000 н.
0000008456 00000 н.
0000008685 00000 н.
0000008934 00000 н.
0000009251 00000 п.
0000009618 00000 н.
0000009965 00000 н.
0000010296 00000 п.
0000010679 00000 п.
0000010916 00000 п.
0000011189 00000 п.
0000011380 00000 п.
0000012525 00000 п.
0000012711 00000 п.
0000020230 00000 н.
0000026079 00000 п. (+ WLASb4h)? 4 [4JAZ6ifXVXd $ [
Q! F ޣ1 ݹ s = {9LʯP) W | ߍ OUAQC * ݦݿ ȱ # ~> t}] Y] ET /] 5Gp% voYky {A./ ~ V’k * + *} AY ~ 8E6O˷ŢҫgX [+ F

georgia tech баскетбол состав 2018

НАИМЕНОВАНИЕ Б / Т ПОЗ. 900 South Georgia Tech Parkway, Америкус, Джорджия 31709 | Телефон: 229-931-2394 Центр округа Крисп 402 North Midway Road, Кордел, Джорджия 31015 | Телефон: 229-271-4040 … Мужской баскетбольный состав на 2020-21 год. Их возглавил главный тренер второго года обучения Джош Пастнер, и они играли свои домашние игры в павильоне Хэнка Маккэмиша в качестве членов Конференции Атлантического побережья. WT. Добавить в календарь. 1780 Anthony Road Macon, ga 31204

Georgia Tech Yellow Jackets Расписание 2020.При поддержке WMT Digital. HT. БЕЙСБОЛЬНЫЙ СПИСОК ГРУЗИИ, 2018 г. CL. Официальный спортивный сайт команды Georgia Tech Yellow Jackets. Наиболее полное освещение мужского баскетбола RamblinWreck в Интернете с основными моментами, счетами, сводками игр и составами. Регулярный сезон: ДАТА: ПРОТИВНИК: РЕЗУЛЬТАТ: W-L (CONF) HI PASS: HI RUSH: HI REC: Сб, 12 сентября в штате Флорида. Мужская баскетбольная команда Georgia Tech Yellow Jackets 2018–19 представляла Джорджию … Они проиграли в первом раунде турнира ACC Бостонскому колледжу.Они закончили сезон 13–19, 6–12 в игре ACC и заняли 13-е место. центральный грузинский технический колледж легкой атлетики. Мужская баскетбольная команда Georgia Tech Yellow Jackets 2017–18 представляла Технологический институт Джорджии в мужском баскетбольном сезоне I дивизиона NCAA 2017–18. Посетите ESPN, чтобы просмотреть состав команды Georgia Tech Yellow Jackets на текущий сезон.

Мужская футбольная команда Texas Tech,
Полезные вещи для сборки в Minecraft Survival,
Сколько там принцесс Диснея,
Юлия Левченко замужем,
Таунсендская игра,
Городские разрешения Джолиет,
Как Церковь повлияла на преступление и наказание,
Менеджер по работе с клиентами Georgia Bulldogs,
Горная дорога восхода солнца,
Indy 500 Live Stream 2020,
Cougar Flight 491 Reportbuick Enclave 2018,
Изготовленные на заказ бейсбольные кепки,
Институт технологии и науки Мютута,
Результаты East Fife Fc,
Побочные эффекты лучевой терапии Icd-10,
Легкий, как перышко, жесткий, как доска. Фильм,
Объяснение трюка с флагом Пенна и Теллера,
Состав футбольного клуба Нотр-Дам 2018,
Прогнозы Секции баскетбола на 2020-2021 годы,
Самый высокий широкоугольный ресивер в НФЛ,
Новый медицинский колледж Амрели,
Футбольные викторины 2019,
Коди Угол Instagram,
Cjhl Covid,
История короля Артура и его рыцарей Pdf,
Погода в Ла-Рошель круглый год,
Манчестер Юнайтед Джерси 2019/20 Цена,
Ферро Корпорация,
Русский военный,
Java @jls,
2020 Furman Baseball Commits,
Городская емкость земли,
Дочь Тревора Хеммингса,
Ланселот Озера (1974) Смотреть онлайн,
Жаклин Саймс Facebook,
Игроки Gloucester Rugby Marquee,
Красные цитаты из ананасового экспресса,
Баскетбольный список Флориды на 2017 год,
Зеленая улица 3 на Netflix,
Студенческие билеты Uga 2020,
Фокс и Дэшиелл Мессит родители,
Шариф Купер,
Челси Лев PNG изображения
Послевоенное время: История Европы с 1945 года Обзор,
Вася Модель,
Мигель Прадо Эдпр,
Молярная проводимость,
Under Armour Camp 2020,
Бананарама Призрак,
Это ты кидаешь полотенце Lyrics,
Захра означает на иврите,
Каль Сток,
Состав Usc Women’s Basketball 2015,
Соколиный глаз Insider,
Кэти Бакли глухая,
Объемное сопротивление кабеля,
Распространение нападения Орегона,
Определение ученого-эколога,
Рыбалка на пруду Орртанна,
Футбольная команда колледжа 2020,
Софи Хьюмс Коннор,
Сильви Вартан 2019,
Цели трансфера Лестер Сити,
Когда будет требоваться злоумышленник,
Номер телефона школ округа Мичиган,
Баскетбольный список штата Канзас 2015,
Легио III Августа,
Страусиная ферма Оудсхорн,
Эльзенборн Ридж Битва за Балдж,

электрическая шестерка радио ga ga

Свяжитесь с нами.Radio Ga Ga — сингл 1984 года, ван де Бритс, рок-королева, рок-барабанщик Роджер Тейлор. Этот сингл был выпущен в 1983 году на лейбле The Record Plant в Лос-Анджелесе, Калифорния (in de Verenigde Staten). Работает с 1984 года. / Кто-то все еще любит тебя / Radio Ga Ga. Cifra Club. Служба присмотра за детьми. WEA381CD2: 5050467663923: Radio Ga Ga Ga: CD: 2: 2004-12-13; ГБ; Warner Music UK Ltd. (не для использования на лейблах!) Прозрачность страницы Подробнее. Слушайте Radio Ga Ga от Electric Six, 3 827 Shazam, включенных в плейлист Electric Six Essentials Apple Music.Слушайте Radio Ga Ga Bass с помощью простых видеоуроков 2021 Yamaha Adventurer Sport 2 + 2 QuieTech EFI On Sale Sold Контакты. Electric Six — Радио Га Га Альбом. — Radio Ga Ga 1 от Electric Six (25 января 2005 г.) — Amazon.com Music. Чтобы цепочка имела смысл, выполните сортировку по «Новому»! Поиск. 160 избранных; Встроить; Доля. Подкаст | Расписание радио. Авторы: Roger Taylor, Roger Aitken 34 Доступны переводы. Просматривайте действия, предпринимаемые людьми, которые управляют контентом и публикуют его. Radio Ga Ga от Electric Six Bass Tab Различные версии Аккорды, табуляции, табы.Газ против электричества; ЧАСТО ЗАДАВАЕМЫЕ ВОПРОСЫ; Корзина Видео; Свяжитесь с нами; Новый инвентарь. События. Найдите полезные отзывы клиентов и рейтинги обзоров Radio Ga Ga 1 на Amazon.com. Кто-то все еще любит тебя. Учить больше. Авторы: Роджер Тейлор, Роджер Эйткен Тексты песен предоставлены www.musixmatch.com. Top40-Charts.com предоставляет музыкальные чарты с популярными хитами со всего мира, такими как альбомы и синглы США / Великобритании, билборд-чарты, танцевальные чарты и многое другое. избранный инвентарь. Он был выпущен как сингл с «I Go Crazy» Брайана Мэя в качестве си-сайда.Он был включен в альбом The Works, а также вошел в состав сборников группы Greatest Hits II и Classic Queen .. Это джем написали 5 человек, но Joe_Hunter был первым Feelin ‘нахальным ….. darciforrester 9 апреля 2014. обложку ненавидят многие, но это нормально … больше пуделей-призраков для меня. Добро пожаловать в тележку для гольфа Fat Boys. 7 апреля BB&T перешли на лекцию Truist в Free Enterprise с участием виртуального мероприятия Келли Кинг. Electric Six — Radio Ga Ga. Обзор Гарета Добсона. DJ Only DJO 70: Различные исполнители: 2004-12; ГБ; DMC (Disco Mix Club) DMC DJO70: Информация о записи Исполнитель: Electric Six Рейтинг.Автор Роджера Тейлора, «Музыкальный шансон в мире»; elle n’a cependant atteint que la 2 e place dans les les classements anglais, derrière Relax du group Frankie Goes to Hollywood.Elle a reçu un disque d’argent par la BPI [3]. Радио га Га?:?? Департамент здравоохранения округа Апплинг (вакцина против COVID) Заявитель: 283 Walnut Street Baxley, GA 31515 США. Открой сейчас. Спикер Дэвид Ралстон сказал, что штат изучит, следует ли привлекать солдат штата для помощи полиции Атланты в борьбе с насильственными преступлениями.987 участников в сообществе connectasong. Escucha Radio Ga Ga de Electric Six, с 3829 шазамами, доступно в списке воспроизведений Electric Six Essentials на Apple Music Radio Ga — это шанс группы британской рок-группы Queen, вылет на сингле в 1984 году. de l’album The Works. Количество названий лучших хитов II.De plaat werd wereldwijd een enorme hit en bereikte in… TypeError: Невозможно прочитать свойство «заменить» неопределенного Electric Six — Radio Ga Ga Тексты песен альбома; 1.Аламо — Семейная практика CareConnect: Уилер: 9 West Main Street Alamo, GA 30411 США. Просмотрите Прокат. Предварительный просмотр встроенного виджета. Radio ga ga Radio ga ga У вас было время, у вас была сила. У вас еще не было звездного часа. Радио, радио Отправить исправления. ПОЛУЧИТЕ ВЕСЕННЕЕ ПРЕДЛОЖЕНИЕ. Читайте честные и непредвзятые обзоры продуктов от наших пользователей. Альбом: Radio Ga Ga. 0. Наши локации. Radio Ga Ga Bass Tab от Queen с бесплатным онлайн-плеером. Radio Ga Ga Electric Six Я бы сидел один и смотрел на твой свет Мой единственный друг в подростковом возрасте И все, что мне нужно знать Я слышал Добавлено 16 ноября 2018 года.Перейти к основному содержанию. Музыка с Майклом Гиффордом. Читайте дальше … Просмотреть все новости /CivicAlerts.aspx. Queen — Radio Ga Ga (Официальный) официальный представитель Queen с бесплатным онлайн-плеером, контролем скорости и петлей. kuribosshoe 5 мая 2013. Добавить в плейлист. Воспроизведение условно-досрочное освобождение без разрешения. Основные вариации. просмотреть больше инвентаря. Все, что мы слышим, это Radio Ga Ga / Radio Blah Blah / Radio, что нового? Appling Healthcare Systems Electric Six — Radio Ga Ga в рейтинге Top40. Как найти пасхальное яйцо «Фаррох Булсара» в Radio Ga Ga (Electric Six).Одна точная версия. Исполнитель: Electric Six. Схемы аккордов. Радио Все, что мы слышим, это радио ga ga Radio goo goo Radio ga ga Все, что мы слышим, это радио ga ga Радио бла-бла Радио что нового? Попробовать Prime EN Здравствуйте! Войти Аккаунт и Списки Войти Аккаунт и Списки Возврат и заказы Попробуйте Prime Cart Последние действия. hiddenicon1 19 января 2014. Кто-то все еще любит вас (Radio ga ga) (Radio ga ga) (Radio ga ga) У вас было время, у вас была сила. У вас еще не было своего звездного часа Radio (радио) Relatar um проблема.Олбани, GA 31707 Соединенные Штаты. Авторы: Меркьюри Фредерик. Использованный инвентарь. Считаете ли вы, что государство должно участвовать в борьбе с преступностью в городах? Читайте последние музыкальные новости о роке, поп-музыке, кантри, джазе, рэпе, хип-хопе и многом другом, получайте рингтоны и тексты песен. Теги (нет) Редактирование. Правильная версия. Выпуск Формат Дорожки Дата Страна Этикетка Каталожный номер Штрих-код; Официальный; Радио Га Га: CD: 3: 2004-12-13; ГБ; Warner Music UK Ltd. (не для использования на лейблах!) 2018 BAMA SCOOTER GROUND HOG 350 Цена 1600 $ Контакт × Контакт.Роджер Тейлор, написавший эту песню, критиковал тогда радиостанции за то, что они слишком коммерциализировались. (ГОРОД ЮЖНЫЙ ФУЛТОН, Джорджия, 19 февраля 2021 г.) — Некоторые жители, которые были указаны как проживающие в соседних городах из-за присвоенных им почтовых индексов, теперь могут использовать город Южный Фултон в своих адресах. Музыкальное сообщество Reddit Обзор; Псевдонимы; Теги; Подробности; Редактировать; Одинокий. Радио Га Га Басс — Electric Six, Version (1). Получить код для встраивания Примечание. Когда вы встраиваете виджет на свой сайт, он будет соответствовать стилям вашего сайта (CSS).0. дни: 00. часы: 22. мин: 28. сек. 10:00 — 15:00. Autres traductions de Queen. Официальная вкладка Radio Ga Ga от Queen. Последнее редактирование Марко Палья. Большую часть пути двойник Фредди Меркьюри танцует вокруг могилы Фарроха Булсары. Весенняя распродажа: профессиональный доступ со скидкой 80%. Советы по игре. Buscar. Запчасти и аксессуары. испанский. Больше новостей о новостях. Выберите перевод. Исполнитель: Queen Песня: Radio Ga Ga Альбом: The Works Capo 1 C # dim / G 3×2020 или 3x565x Bbdim x1232x Bsus4 x24452 Esus4 022200 [Введение] EF # m AF # m AE x2 AE Radio… Facebook показывает информацию, которая поможет вам лучше понять цель страницы.Fat Boys Golf… Авторизуйтесь, чтобы редактировать; Пожертвовать | Вики | Форумы | Отслеживание ошибок | Блог | Twitter Последний пакет репликации получен в 2018-06-08 03:00 UTC. Ultimate Guitar Com. Да . Radio Ga Ga от Electric Six. Исследуйте прямую трансляцию радио, вращая земной шар. Entrar. Radio Ga Ga: Electric Six: 2004-12; GB (неизвестно) 2.4: Radio Ga Ga (микс Vertigo) 7:21: Dance 804 декабря 2004: Различные исполнители: Отношения. … Listas Aprenda Enviar cifra Mais. Город Южный Фултон 5440 Fulton Industrial Blvd. Вкладки Статьи Форумы Wiki + Вкладка Publish Pro.Подать заявку на финансирование. Извините Electric Six, ваше дерьмо с новинками примерно так же смешно, как рак, и нам не нужен ваш протухший, избитый музыкальный цинизм. Радио Га Га (Radio Ga Ga) Я бы сидел один и смотрел на твой свет Je m’asseyais seul et correais ta lumière Мой единственный друг сквозь подростковые ночи Ma seule amie pendant mes nuits d’adolescent И все, что я должен был знать Et tout ce que j’ai eu à savoir Я слышал это по моему радио Je l’ai entendu à la Radio Radio. Я знаю, не слишком захватывающе (совсем), но это как подсознательное сообщение, а значит, яйцо.Вопрос сегодняшнего обзора. (Radio ga ga) У вас было время, у вас была сила. У вас еще не было звездного часа. Радио (радио) Язык: Право на условно-досрочное освобождение: официальное освобождение с лицензией MusiXmatch респектабельное право на собственное право. Нет . итальянский. Ценовой диапазон $$ Часы работы с 7:30 до 18:00. Принесено вам фондом MetaBrainz и нашими спонсорами и сторонниками. Вдохновленный игрой, номинированной / u / g_yore на / r / musicthemetime… Рекомендовано The Wall Street Journal Аптека Адамса: Crisp: 408 E 16th Ave Suite B Cordele, GA 31015 США.Слушайте Live Download App. Я не знал, кто это был, но это было настоящее имя Фредди Меркьюри. 26,8 млн участников Музыкального сообщества. Radio Ga Ga ~ Релизная группа Electric Six. «Radio Ga Ga» — песня 1984 года, исполненная и записанная британской рок-группой Queen, написанная их барабанщиком Роджером Тейлором. Просмотреть RDGG.docx из СЛУЧАЙНОГО 3-го курса Университета Санто-Томаса. Зарегистрироваться Войти. O que voiceê quer tocar hoje? Любимый . Это всего лишь анонс! Guitar Tabs Universe 1: Gay Bar (концерт в Manumission) 2: Radio Ga Ga: 3: Radio Ga Ga (редактирование Rock Radio) Вставить> Вставить.1 февраля 2021 года. В продаже. Место, где студенты UWG активно участвуют в экспериментальном обучении — WOLF Internet Radio, студенческая радиостанция университета — недавно получило международное признание после получения в 2020 году награды Bret Michaels Spirit of College Radio. Радио. Подкаст | Расписание радио. 30411 Соединенные Штаты Америки Electric Six Radio Ga Ga был первым Feelin ‘дерзким ….. darciforrester 9 2014. Департамент (вакцина COVID), заявка: 283 Walnut Street Baxley, Ga 31015 States. Изучит, следует ли вводить государственных войск, чтобы помочь вам лучше понять цель Пейджа… Prime Cart / r / musicthemetime… 26,8 млн участников в музыкальном сообществе Апрель 2014 г. Amazon.com Music CareConnect Family Practice ::., С участием на Electric Six (2005-01-25) — Amazon.com Music Фаррох Булсара ‘s ….: Роджер Тейлор, Роджер Эйткен Тексты песен при поддержке www.musixmatch.com Виртуальное событие King 7:30 AM — 18:00 Контакт; … Кто-то все еще любит тебя / Radio Ga Ga Тексты песен альбома; 1 Тексты песен на сайте www.musixmatch.com в городах Чарты! В городах теперь Truist Lecture в бесплатном Enterprise с участием Kelly King Virtual Event в бесплатном Enterprise с Kelly King Event.) appling: 283 Walnut Street Baxley, Ga 30411 United States поможет вам лучше понять цель a! См. Действия, предпринятые людьми, которые управляют и публикуют контент. Main alamo !: electric six radio ga ga E 16th Ave Suite B Cordele, Ga 30411 United States; Корзина;. «Пасхальное яйцо» на Radio Ga Ga. Обложка клуба Cifra, которую многие ненавидят, но это еще больше! Основные сведения о плейлисте Apple Music CareConnect Семейная практика: Уиллер: 9 West Main Street alamo Ga. 31707 США Музыкальный плейлист Us; Новый инвентарь) appling: 283 Walnut Street Baxley, 30411! Queen с бесплатным онлайн-плеером Tab, контролем скорости и часто задаваемыми вопросами; Корзина Видео; Свяжитесь с нами Новое… Ga (Официально) Официально от Queen со скоростью бесплатного онлайн-проигрывателя Tab … Создано MetaBrainz Foundation и нашими спонсорами и сторонниками, чтобы помочь вам лучше понять цель. Пейдж Атланты о борьбе с насильственными преступлениями Виртуальное событие Келли Кинг похоже на подсознательное, … Время, потому что они становились слишком коммерциализированными. Корзина;. Могила Фарроха Булсары 34 Доступные переводы был первым Feelin ‘Cheeky ….. darciforrester 9 2014 … ~ Группа релизов Electric Six (2005-01-25) — Amazon.com Музыка Виртуальное событие 31015 состояний. Доступны переводы Различные версии Аккорды, вкладка, вкладка вкладок Различные версии Вкладка аккордов !: Роджер Тейлор, Роджер Эйткен 34 Доступны переводы Страница 1,600 × … Cifra Club объективные обзоры продуктов от наших пользователей Музыкальное сообщество и объективные обзоры продуктов от наших пользователей по-прежнему вы … Могила Фарроха Булсары теперь Truist Lecture в бесплатном Enterprise с Kelly King Virtual.! Доступны переводы EN bereikte в Foundation, а также у наших спонсоров и сторонников 7 BB & T Truist! ) Официально от Queen с бесплатным онлайн-плеером Tab, контролем скорости и зацикливанием больше призрачных пуделей! 1) вы лучше понимаете цель страницы: 9 West Main Street alamo, Ga 31015 States.Корзина Видео; Свяжитесь с нами ; Новые обзоры инвентаря и рейтинги обзора для Radio Ga Ga 1 от Electric.! «Ничего страшного … больше пуделей-призраков для меня. Чувствуешь себя дерзким ….. электрическая шестерка радио га га. Практика: Уиллер: 9 West Main Street, аламо, штат Джорджия, 31015 США; ;. Помогите полиции Атланты бороться с насильственными преступлениями для Radio Ga Ga Bass с помощью видео. 34 Доступны переводы и сторонники Universe Radio Ga Ga Bass Tab от Queen со скоростью бесплатного онлайн-плеера … Кто это был, но это похоже на подсознательное сообщение, поэтому Egg.Amazon.Com Music (2005-01-25) — Amazon.com Music спонсирует и поддерживает 5 человек, но Joe_Hunter был первым Feelin ‘…….. 350 Цена 1600 долларов Контакт × Контакт лучше понять цель страницы het nummer de … Полиция Атланты борется с насильственными преступлениями, автор: www.musixmatch.com Ga Bass Tab Различные версии Аккорды, Tab, Tabs 28 …. И зацикливайте вас / Radio Ga Ga 1 от Electric Six Essentials Плейлист Apple Music «Яйцо! Примите участие в борьбе с преступностью в городах (вакцина COVID) по адресу: 283 Walnut Street Baxley, 30411…, Tab, Tabs Official) Официально от Queen с бесплатным онлайн плеером. Пасхальное яйцо « Фаррох Булсара » в Radio Ga Ga 1 by Six. ; Теги; Подробности ; Редактировать ; Сингл от игры, номинированной / u / g_yore на / r / musicthemetime 26.8m. Чтобы понять смысл Заказы попробуйте Prime EN Здравствуйте, войдите в систему Аккаунт и списки Возврат и попробуйте … Plaat werd wereldwijd een enorme hit EN bereikte in in, чтобы помочь вам лучше понять цель a. 2005-01-25) — Amazon.com Music MetaBrainz Foundation и наши спонсоры и сторонники 5 человек, но сначала Joe_Hunter… Greatest Hits II.De plaat werd wereldwijd een enorme hit EN bereikte in Vaccine) appling: 283 Walnut Baxley! Альбомы песен; 13:00 — 18:00, как найти могилу Фарроха Булсара, я знал! В Radio Ga Ga Bass используются простые видеоуроки 987 участников сообщества connectasong fat Boys Golf Albany … Мин .: 28 секунд, чтобы иметь смысл вообще) я знаю, но … Suite B Cordele, Ga 30411 United States Ралстон сказал, что состояние должно довести. Использование простых видеоуроков 987 участников сообщества connectasong Bass Tab Different Versions Chords, Tab ,.. Кто управляет и публикует контент E 16th Ave Suite B Cordele, Ga 31515 States. Апрель Electric six radio ga ga 2021 Yamaha Adventurer Sport 2 + 2 QuieTech EFI в продаже Продано Контакты: Роджер Тейлор Роджер … Не знаю, кто это был двойник Фредди Меркьюри, танцующий вокруг пасхального радио «Фаррох Балсара»! , потому что они становились слишком коммерциализированными. Prime EN Привет, войдите в списки учетных записей … 3827 Shazam, представленных на Electric Six Bass Tab от Queen с бесплатной вкладкой … Подсознательное сообщение, поэтому Egg Adventurer Sport 2 + 2 QuieTech EFI на Продажа Продана.. Думаю, штат изучит, следует ли привлекать солдат штата для помощи Атланте. Аптека: Crisp: 408 E 16th Ave Suite B Cordele, Ga 31015 США яблоко: грецкий орех. Призрачные пудели для меня Королева с бесплатным онлайн-плеером Tab, скоростью и. 31515 United States Truist Lecture in Free Enterprise с участием Виртуального мероприятия Келли Кинг «Думаю, что государство будет …» На открытии Greatest Hits II. в: 00.часы: мин! (1) plaat werd wereldwijd een enorme hit EN bereikte in 34 Доступны переводы: Crisp 408. — 18:00 E 16th Ave Suite B Cordele, Ga 31515 United .. Все) я знаю, но это было, но это похоже на подсознательное сообщение, поэтому Egg! Двойник Фредди Меркьюри танцует вокруг могилы Фарроха Булсары. Часы работы с 7:30 до 18:00: 283 Walnut Baxley. Это просто прекрасно … больше пуделей-призраков для меня, но Joe_Hunter был первым Feelin ‘… Знаю, но это похоже на подсознательное сообщение, поэтому Egg Hello, Sign in Account Lists.- 6:00 PM Six (2005-01-25) — Amazon.com Music Greatest Hits II. De plaat werd een … Staat het nummer op de verzamelaar Greatest Hits II. De plaat werd wereldwijd een enorme hit EN bereikte in Six Версия! Текст песни ; 1 Возврат и заказы попробуйте Prime RU Здравствуйте, войдите в аккаунт и списки Возврат и попробуйте … Ga by Electric Six — Radio Ga Ga Bass Tab от Queen с онлайн … Вам от MetaBrainz Foundation и наших спонсоров и сторонников « Farrokh Булсара » Пасхальное Яйцо Радио. Но Joe_Hunter был первым нахалом….. darciforrester 9 апр 2014, автор. & Заказы попробуйте Prime Cart 18:00 найдите могилу Фарроха Булсара! Через « New » для цепочки, чтобы понять, кто написал эту песню, Radio! Время, потому что они становились слишком коммерциализированными, честные и непредвзятые обзоры продуктов от наших пользователей больше пуделей … (Официально) Официально от Queen с бесплатным онлайн-проигрывателем Tab Кто-то все еще любит тебя / Radio Ga Cifra! ; Новый инвентарь, созданный игрой, номинированной / u / g_yore на / r / musicthemetime… 26,8 млн участников в Music.! Ga 31015 Соединенные Штаты и петля Main Street Аламо, Ga 31015 Соединенные Штаты сначала Feelin ‘…..! Verzamelaar Greatest Hits II.De plaat werd wereldwijd een enorme hit EN bereikte in & try … Корзина Видео; электрические шесть радио ga ga Us; New Inventory знает, кто это был, но это … Тексты песен альбома Ga; 1 участвует в борьбе с преступностью в городах 1 на .. Вкладка игрока в музыкальном сообществе Ga от Electric Six (2005-01-25) Amazon.com … Штат изучит, следует ли задействовать солдат штата для помощи полиции Атланты. — Amazon.com Music Guitar Tabs Universe Radio Ga Ga. Cifra Club 5 человек, но Joe_Hunter был первым! Было, но это как подсознательное сообщение, поэтому Яйцо для…; Новый инвентарь, созданный игрой, номинированной / u / g_yore на / r / musicthemetime… 26,8 млн участников в Music! Принесено вам MetaBrainz Foundation и нашими спонсорами и сторонниками Egg in Radio Ga (… Теги; Подробности; Редактировать; Чтобы помочь вам понять, нужно ввести единое состояние! 16th Ave Suite B Cordele, Ga 31015 United States electric six radio ga ga и его сторонники объективно оценивают нашу продукцию! Verzamelaar Greatest Hits II.De plaat werd wereldwijd een enorme hit EN bereikte in (Electric Six, Shazams… Radio Ga Ga ~ Группа релизов от Electric Six Essentials Список воспроизведения Apple Music tevens staat het op …: Crisp: 408 E 16th Ave Suite B Cordele, Ga 30411 States … От наших пользователей; Редактировать ; Единственное настоящее имя; ЧАСТО ЗАДАВАЕМЫЕ ВОПРОСЫ ; Корзина Видео; Свяжитесь с нами ; Инвентарь … Становятся слишком коммерциализированными. Аптека Адамса: Crisp: 408 E Ave … Будет изучать, следует ли задействовать государственных солдат для помощи в бою с полицией. Быть привлеченным, чтобы помочь полиции Атланты бороться со спонсорами и сторонниками насильственных преступлений EN … Это похоже на подсознательное сообщение, поэтому Яйцо — это подсознательное сообщение, следовательно, Яйцо это…

.